Fondazione, procedura e usi dell'ossidasi

IL Test ossidasi È un metodo diagnostico che mostra la presenza del complesso enzimatico chiamato citocromo ossidasi C. Questo sistema induce la trasformazione del citocromo ossidato ridotto, poiché cattura l'ossigeno e questo a sua volta funge da ultimo accettore di elettroni (H⁺) Nella catena respiratoria.

Il termine ossidasi è un modo sommario per fare riferimento all'enzima di citocromo ossidasi, noto anche come ossidasi indefenolo. Nei tempi antichi si credeva che gli enzimi di citocromo ossidasi e indeofenolo ossidasi fossero due enzimi diversi, ma oggi è noto che sono gli stessi.

Test ossidasi positivo e negativo. Fonte: nessun autore leggibile da macchina fornita. Alfa.Prim ~ Commonswiki assunto (basato su reclami di copyright). [Dominio pubblico]

Da parte loro, i citocromi sono emoproteine ​​che contengono ferro e completano il sistema di citocromo ossidasi. I citocromi possono variare da una specie all'altra.

Esistono diverse varietà di citocromi (citocromi A1, A2, A3 e 0). Alcuni batteri possono produrre solo uno, ma altri fino a due allo stesso tempo. In questo senso, la presenza di citocromo A e A3 è nota come citocromo - ossidasi C. Questo è il tipo di citocromo che rileva il test di ossidasi.

I generi di Neisseria e Pseudomonas contengono citocroma ossidasi C. Questi generi forniscono il test di ossidasi positivo, aiutando a differenziarli rispettivamente dai generi di acinetobacter e stenotrophomonas.

Ci sono anche altri generi che sono ossidasi positivi.

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Base

Caratteristiche del sistema di citocromo ossidasi C

Il sistema cococro ossidasi C agisce come segue: i microrganismi di ossidasi positivi usano l'ossigeno per generare energia attraverso la respirazione aerobica. Questo sistema funziona grazie al trasporto di elettroni da sostanze donatori come NADH⁺ Verso la ricezione di sostanze, in questo caso ossigeno.

Ciò si traduce in energia (ATP) e perossido d'acqua, a seconda del sistema di citocromo ossidasi che possiede il microrganismo.

Ecco perché la maggior parte dei batteri ossidasi positivi sono anche una catalasi positiva, una condizione necessaria per eliminare il perossido di idrogeno prodotto, poiché questa sostanza è tossica per i batteri.

Il sistema del citocroma ossidasi C è presente in alcuni batteri aerobici, alcuni anaerobici opzionali, scarsi microaerofili e nessun rigoroso anaerobico. Quest'ultimo è comprensibile, poiché gli anaerobi rigorosi non possono vivere in presenza di ossigeno, quindi mancano del sistema del citocromo ossidasi.

Principio di prova

In questo test utilizzare sostanze che fungono da accettori di elettroni artificiali, sostituendo i nativi all'interno della catena di trasporto degli elettroni.

Vengono utilizzati principalmente coloranti come la parafenilendiamina e l'indofenolo, che fungono da substrati di recettori e donatori di elettroni artificiali.

La parafendiamina è ossidata dal sistema del citocroma ossidasi C. Il colorante nella sua forma ridotta è incolore, ma nella sua forma ossidata è colorato.

Ecco come la presenza del sistema Cytocromo ossidasi C; Bene, una reazione positiva genererà una colorazione lavanda o blu -Púrpura a seconda del reagente utilizzato.

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D'altra parte, se l'ultima sostanza dell'accettore di elettroni nella catena respiratoria è diversa dall'ossigeno, il test di ossidasi darà negativo (non esiste una produzione di colore); Questo è il caso dei microrganismi anaerobici.

Allo stesso modo, se il citocromo usato dal microrganismo è diverso dal citocromo ossidasi C, darà anche il test negativo.

Procedura

Per il test dell'ossidasi ci sono diversi reagenti e protocolli, tutti con lo stesso scopo.

Reagenti

Kovacs Reactive, Gordon e McLeod Reagent, Nadi Reagent, Carpenter Reagent, Suhrland e Morrison e l'uso di dischi di ossidasi.

-Reagente Kovacs ossidasi

È costituito da tetrametil-P-fenilelendiamina dicloroidrato all'1%.

Il reagente Kovacs viene preparato dissolvendo 1 gr della sostanza menzionata in 50 ml di acqua distillata. È leggermente riscaldato fino alla sua soluzione totale. Trasferire in una bottiglia ambra di capacità sufficiente e completare il volume a 100 ml con acqua distillata. Attendere almeno 15 minuti prima di usare. Salva in frigo protetto dalla luce.

Viene ruotato come un reagente Kovacs ossidasi, per differenziarlo dal reagente Kovacs usato per rivelare il test Indol. Questo reagente è il più sensibile, meno tossico ma più costoso del resto dei reagenti.

Una reazione positiva sarà la prova. Una reazione negativa è evidenziata perché non vi è alcun cambiamento di colore nella colonia o impiega una leggera colorazione rosa. Il mezzo può anche scurire, ma ciò non significa una reazione positiva.

Con questo reagente il tempo di reazione è cruciale, quel cambiamento di colore che si verifica tra 5 e 15 secondi è considerato una reazione positiva.

-Reagente Gordon e McLeod

È composto da dimetil-p-fenilendiammina dicloroidrato, noto anche come N-dimetil-P-fenilelendiamina o p-amynodimetilanilina p-amocoridratarte. È preparato come descritto per il reagente Kovacs ossidasi, sostituendo la sostanza coinvolta.

Questo reagente è leggermente più stabile del reagente Kovacs ossidasi, sebbene tutti i reagenti contenenti p-penilendiamine siano instabili.

Questa reazione è in ritardo.

-Reagente Nadi

È composto da 1% α-naftulo nell'alcool etilico (95% di etanolo) e all'1% di amina-limanilina. La miscela viene preparata in parti uguali e utilizzando alcol etilico assoluto come dilimo, fino a quando la quantità sufficiente non viene completata per 100 ml.

-Carpenter Reactive, Suhrland e Morrison

È composto da 1% di p-aminodimetilalanina ossalato. Preparati allo stesso modo a quello descritto per il reagente Kovacs ossidasi, cambiando per la sostanza corrispondente.

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Con la soluzione pronta, le strisce reattive vengono preparate come segue: Whatman 6-8 cm Numero 1.

Sono autorizzati ad asciugarsi senza avere contatto con il metallo, salvare il filo di barattoli con essiccante e rimanere in frigorifero. Queste strisce sono stabili per un massimo di 6 mesi.

È il reagente più stabile di tutto menzionato, essere in grado di durare in soluzione fino a 6 mesi. Un altro punto a favore è che il mezzo non colora la colonia, se viene utilizzato direttamente sulla piastra.

L'aspetto di un colore rosso viene interpretato come un test positivo.

-Dischi ossidasi

Sono dischi commerciali che sono impregnati di reagente per il test dell'ossidasi. Ci sono diversi marchi commerciali sul mercato.

Il suo uso è abbastanza pratico, poiché non dobbiamo preparare reagenti freschi, il che facilita il lavoro. I risultati ottenuti sono affidabili fintanto che i dischi sono adeguatamente conservati.

Protocolli

Metodo della piastra diretta, metodo indiretto sulla carta e uso di dischi impregnati con reagenti ossidasi.

-Metodo della piastra diretta

2 o 3 gocce di uno qualsiasi dei suddetti reagenti vengono aggiunti a questo scopo direttamente sulle colonie contenute in una piastra di medio di coltura che non contiene glucosio.

Viene interpretato il cambiamento o no il colore delle colonie, non il mezzo. Il tempo di reazione valido dipende dal reagente utilizzato.

-Metodo indiretto su carta

Taglia un pezzo di carta da filtro (Whatman N ° 1) a una dimensione di 6 cm² Ed è posizionato all'interno di una Petri vuota.

Aggiungi 2 o 3 gocce del reagente Kovacs ossidasi su carta, prendi parte alla colonia che si desidera studiare con una maniglia di platino o un bastone di legno ed estenderlo in linea retta sulla carta reagente impregnata. Interpretare in un periodo da 5 a 10 secondi.

Con le strisce preparate con il reagente Carpenter, Suhrland e Morrison, una colonia si estende sulla striscia asciutta. La stessa striscia serve a provare diversi ceppi. Interpreta su 10 secondi.

-Dischi (mETHOD diretto)

Inumidiscono sottilmente i dischi commerciali con acqua distillata sterile e superano la colonia per studiare. Si consiglia di utilizzare le piastre a 35 ° C, se le piastre vengono utilizzate a temperatura ambiente o piastre refrigerate La reazione è un po 'più lenta. Interpretare il cambiamento di colore tra 10 e 20 secondi.

Le colonie contenute nel sangue o nel cioccolato possono essere utilizzate.

-Dischi (metodo indiretto)

Inumidire l'album come descritto sopra. Posizionalo su una Petri vuota. Prendi sufficiente quantità di colonia per studiare con una maniglia di platino o un bastoncino di legno e posizionati sul disco. Interpretare il cambiamento di colore tra 10 e 20 secondi.

Utilizzo

Il genere neisseria e acinetobacter a volte assomigliano molto a morfologicamente perché sebbene il genere acinetobacter sia un bacillo gram negativo, a volte può adottare una forma cocoidale e distribuire in coppia, simulando il genere neisseria.

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In questo caso il test dell'ossidasi è davvero utile. La neisseria di genere è positiva e negativa acinetobacter.

Tuttavia, il genere Moraxella è molto simile al genere Neisseria ed entrambi danno una reazione positiva; Ecco perché dobbiamo sempre eseguire test di fermentazione dei carboidrati per l'identificazione definitiva.

D'altra parte, il test dell'ossidasi è utile per differenziare un batterio appartenente alla famiglia Enterobacteriaceae (tutta ossidasi negativa) di altri fermers, come il genere pastural, aeromoni, plesiomonas (ossidasi positiva).

Il genere Vibrio e Helicobacter sono anche ossidasi positivi.

QA

Usa ceppi noti di Escherichia coli come controllo negativo e ceppi di Pseudomonas aeruginosa come controllo positivo.

Limitazioni

-I reagenti devono essere usati di recente preparati, la loro vita utile a temperatura ambiente è abbreviata per essere molto instabile. Il refrigerato può durare tra 5 giorni a 2 settimane.

-I reagenti sono incolori, se cambiano colore devono essere scartati. I dischi danneggiati sono evidenti perché diventano buio nel tempo.

-Una reazione positiva con il reagente ossidasi di kovac tra 15-60 sec è considerata una reazione ritardata e dopo 60 secondi dovrebbe essere considerata negativa.

-Lui Haemophylus influenzae Dà una reazione di ossidasi negativa se viene utilizzato un reagente con dimetil-p-fenilelendiamina, ma positivo se viene utilizzato il reagente ossidasi di kovac (tetrametil-p-fenilelendiamine)).

-I media contenenti glucosio interferiscono nel test, falsamente negativo.

-I ceppi di Bordetella pertussis Possono dare una reazione falsamente positiva se provengono da piastre di agar nel sangue molto concentrate.

-L'uso di maniglie metalliche (ferro) che dà una reazione falsamente positiva.

Raccomandazioni

-Perché i reagenti sono molto instabili e tendono a sé.

-Un altro modo per ritardare l'auto-outlet del reagente è aggiungere l'acido ascorbico allo 0,1% al momento della preparazione dei reagenti.

-Poiché i reagenti sono instabili, si consiglia di eseguire il controllo di qualità settimanale.

-I reagenti che non superano il test di controllo della qualità non devono essere utilizzati.

Riferimenti

1. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnosi microbiologica. 5 ° ed. Pan -American Editoriale S.A. Argentina.
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