Fondazione tampone fosfato (PBS), preparazione e usi

Lui tampone fosfato, bps o tampone fosfato salino È una soluzione tampone e isotonica, la cui funzione è mantenere il pH e la pressione osmotica il più vicino all'ambiente ambientale (fisiologico). L'acronimo di PBS media salino tamponato fosfato.

PH e osmolarità sono due aspetti molto importanti che devono essere controllati in determinati protocolli di laboratorio. Nel caso del pH è essenziale che sia controllato, specialmente nelle reazioni biochimiche, poiché questi possono variare o meno se i reagenti sono in un pH inappropriato.

Tampone salino pbs fosfato in due diversi pH. Fonte: Pixinio.com

Mentre, il controllo dell'osmolarità è essenziale soprattutto quando si lavora con le cellule viventi, poiché le membrane plasmatiche delle cellule reagiscono in base alla concentrazione di soluti in cui si trovano.

Se le cellule vengono trasferite su un mezzo ipertonico, si disidraranno, poiché il gradiente dell'acqua verrà trasportato di lato dove vi è una maggiore concentrazione di soluti. Se, al contrario, le cellule vengono posizionate in un mezzo ipotonico, le cellule assorbiranno il fluido fino a mistere.

Ecco perché viene utilizzato il tampone PBS per i protocolli di laboratorio che richiedono la manutenzione cellulare In vitro, In questo modo le celle non saranno danneggiate.

PBS è composto da una combinazione di sali, come cloruro di sodio, fosfato di sodio, cloruro di potassio e fosfato di potassio. La composizione PBS può variare a seconda del protocollo.

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Base

Fondamentalmente la funzione del tampone fosfato salino è quella di mantenere un pH fisiologico costante accanto a una concentrazione elettrolitica simile a quella all'interno dell'organismo.

In questo ambiente le cellule sono in grado di rimanere stabili, poiché le condizioni fisiologiche simulano il più possibile.

Alla formulazione PBS originale, possono essere aggiunti altri composti di essere necessari, ad esempio l'aggiunta di EDTA al tampone è utile per il lavaggio dei globuli rossi nel test incompatibilità incrociata.

L'EDTA impedisce la frazione del complemento C1 presente nel siero, di dividere e raggruppare i globuli rossi, cioè evitare falsi risultati di incompatibilità. Inoltre, EDTA aiuta a dissociarsi le cellule.

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Preparazione

La quantità di sali che deve essere pesata per l'elaborazione del PBS salino fosfato dipenderà dalla quantità necessaria per preparare:

-Soluzione tampone tampone Salino phfosfato (PBS 10x)

Per un litro di soluzione:

Pesare:

80,6 g di NaCl,

2,2 g di KCl,

11,5 g di Na₂HPO₄,

2,0 g di KH₂HPO₄

Tecnica di preparazione

In un becher posizionare i sali pesanti, aggiungere abbastanza acqua (80%) e mescolare sulla piastra agitata con barra magnetica fino a quando i sali si dissolvono.

Preparazione PBS con ferro agitato con barra magnetica . Fonte: Utente: Ruhrfisch, Wikipedia. com

Filtro per rimuovere le particelle di distorsione. Usa filtri con pori 0,45 µm. Sterilice autoclave e distribuisce asetticamente nella campana di flusso laminare in barattoli di vetro con coperchio.

Alla soluzione 10x (concentrata) non regola il pH. La regolazione viene effettuata una volta diluita alla concentrazione di PBS 1x tampone (diluizione 1:10).

-Tampone fosfato salino (PBS 1x)

PBS 1x può essere preparato direttamente, pesando le quantità corrispondenti di ciascun sale o può preparare diluire la soluzione madre (1:10) con acqua distillata sterile.

-Per preparare direttamente un litro di fosfato salino PBS 1x Rimpianto:

8,06 g di NaCl,

0,22 g di KCl,

1,15 g di Na₂HPO₄,

0,20 g di KH₂HPO₄

Tecnica di preparazione

Procedere come spiegato nella soluzione concentrata. Successivamente il pH deve essere regolato. Per fare ciò, misurare il pH e, a seconda del risultato, utilizzare acido (HCl) o base (NaOH) per abbassare o caricare il pH rispettivamente se necessario, fino a quando non è 7,4.

L'acido o la base viene aggiunto a goccia mediante caduta mentre monitora il valore del pH della soluzione usando un pH-metro. Filtra, sterilice autoclave e distribuisce asetticamente in tubi o bottiglie conici, se necessario.

-Per preparare il PBS 1x dalla soluzione madre 10x:

Fare una diluizione 1:10. Ad esempio, per preparare 1 litro di PBS 1x, misurare 100 ml della soluzione madre e aggiungere 700 ml di acqua distillata sterile. Regolare il pH e completare la quantità di acqua fino a raggiungere 1000 ml.

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Il tampone PBS preparato è incolore e trasparente.

L'uso giornaliero PBS può essere conservato a temperatura ambiente e il resto in frigorifero.

.Soluzioni per l'impostazione del pH

HCl

Per 100 ml di HCl (acido cloridrico) a 1 molare.

Misurare 91 ml di acqua distillata e posizionarla in una nave precipitata di 250 ml di capacità.

Misurare 8,62 ml di HCl concentrato e aggiungerlo lentamente al becher contenente l'acqua (non lo fa mai a testa in giù). Adottare misure di biosicurezza rilevanti quando si gestiscono acidi forti (sostanza altamente corrosiva).

Mescolare per 5 minuti usando una piastra agitata con una barra magnetica all'interno del vetro. Vai a una palla da 100 ml e scaricati a 100 ml con H₂O distillato.

Naoh

Per 100 ml di NaOH (idrossido di sodio) 10 molari.

Misurare 40 ml di acqua distillata e posizionarlo in un becher di capacità di 250 ml. Misura 40 gr di Naoh e aggiungi all'acqua. Mescolare usando una piastra agitata con una barra magnetica all'interno del vetro.

Vai a una sfera aggroversa da 100 ml e a filo con acqua distillata. Rispettare gli standard di biosicurezza, poiché questa reazione è esotermica (rilascia energia sotto forma di calore).

Se si desidera preparare altre quantità di soluzione salina fosfato, è possibile consultare la seguente tabella:

Fonte: "Laboratorio di genomica virale e umana, UASLP School of Medicine"

Applicazioni

Principalmente viene utilizzato nei laboratori di biologia cellulare, immunologia, immunoistochimica, batteriologia, virologia e ricerca.

È l'ideale per effettuare il lavaggio cellulare per centrifugate (globuli rossi), monocapas cellulare lavata, in tecniche di ellipometria spettroscopica, nella quantificazione dei biofilm batterici, nel mantenimento delle colture cellulari per i virus immunofluorescenza e nelle tecniche per la caratterizzazione degli anticorpi monoclonali.

Serve anche a trasportare cellule o tessuti, come diluente per il conteggio delle cellule, la preparazione di enzimi cellulari (Tripsin), come diluente del metodo di essiccazione delle biomolecole e per preparare altri reagenti.

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D'altra parte, Martin e collaboratori nel 2006 hanno mostrato che la PBS è utile nei laboratori scientifici forensi, in particolare nel recupero dello sperma da striscio vaginale o nel recupero delle cellule vaginali dello striscio del pene. In questo modo può essere stabilito se c'è stata una relazione sessuale.

Limitazioni

-Alcuni tamponi PBS portano come conservante una sostanza chiamata sodio azide. Questo composto può generare sostanze esplosive se viene in contatto con il piombo o il rame. Per questo motivo, è necessario prestare particolare attenzione quando si scarta questo reagente per il drenaggio. Se scartato da questo percorso, è necessario aggiungere un'acqua abbondante per diluire al massimo.

-Il tampone fosfato non deve essere aggiunto zinco, poiché precipita alcuni sali.

-Wangen e collaboratori nel 2018 hanno stabilito che l'uso di PBS non era adatto al lavaggio della leucemia mieloide acuta primaria (AML) estratta dal sangue periferico, poiché molte cellule sono perse dalla lisi, con una grande diminuzione del materiale proteico.

Pertanto, hanno determinato che le cellule primarie AML non devono essere lavate con PBS dopo lo stoccaggio in azoto liquido.

Riferimenti

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