Colorazione negativa

Immagine della colorazione negativa del virus dell'influenza a. Fonte: vedi pagina per l'autore, Wikimedia Commons

Cos'è la colorazione negativa?

IL colorazione negativa È un metodo di colorazione speciale per evidenziare la presenza della capsula in alcuni microrganismi, Mainly Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae E Cryptococcus neoformans-, da campioni clinici o colture pure.

Il campione diretto usato direttamente per applicare la colorazione negativa è il liquido cerebrospinale. Questa tecnica rappresenta una rapida alternativa per la diagnosi presuntiva della meningite, specialmente da Cryptococcus neoformans.

Questa colorazione può essere applicata a espettorato e liquidi sterili in generale, nonché su ceppi ottenuti da giovani colture pure. La tecnica utilizza l'inchiostro nigrosina o cinese per la sua esecuzione, quindi è una metodologia molto semplice ed economica da applicare che fornisce informazioni di grande valore diagnostico in breve tempo.

In questo senso, qualsiasi laboratorio ha la capacità di eseguire questa colorazione. Naturalmente, il laboratorio deve avere un personale competente, in grado di riconoscere i lieviti del Cryptococcus neoformans isolati o in gemazione e differenziarli da leucociti e artefatti che il campione può presentare.

Base

Lo stesso Nigrosine e Ink Chinese Ink Act, quindi entrambe le sostanze possono essere usate indistinte.

Questa tecnica è chiamata colorazione negativa perché agisce contrariamente al resto delle tecniche di colorazione. In questo, ciò che è senza tingere è la struttura che viene ricercata o che vuoi vedere, cioè microrganismi.

Pertanto, la colorazione si basa sulla tintura del fondo dello striscio in un colore scuro. In questo scenario, le strutture capsulate evidenzieranno in luce o incolore.

Di solito, si osservano i lieviti, circondati da un alone chiaro che corrisponde alla capsula. Ciò si verifica perché l'inchiostro cinese e la nigrosina sono sostanze incapaci di penetrare nel polisaccaride che forma la capsula dei microrganismi viventi.

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Va notato che altre strutture che possono essere presenti nel campione diretto, come leucociti o globuli rossi.

Ora, se i microrganismi sono morti, la tintura può penetrare in essi, in modo che questa colorazione sia utile anche per valutare la vitalità dei microrganismi.

Tecnica

Materiali

Nigrosina

Nigrosina deve il suo nome al colore nero che ha. È una sostanza sintetica che si ottiene dal riscaldamento della miscela di composti organici, come nitrobenzeina, anilina e anilina idroclorito -, usando in quella reazione un catalizzatore (ferro o rame).

Inchiostro cinese

L'inchiostro cinese è una sostanza usata principalmente dagli asiatici per la scrittura, l'elaborazione di opere d'arte e dipinto monocromatico. È molto popolare nella cultura cinese.

È ottenuto dall'inchiostro di calamari miscelato con carbone in polvere, prodotto della combustione di piccoli alberi resinosi.

È anche possibile prepararlo dalla fuliggine dell'incenimento dell'idrocarburo (oli vegetali), insieme a una gelatina proteica che gli dà la consistenza appropriata per evitare la precipitazione delle particelle di carbone.

Specifiche per il campionamento

• Non richiede il digiuno.
• Il campione, espettorato o liquido sterile deve contenere almeno 1 ml di volume e deve essere trasferito in laboratorio a temperatura ambiente.
• Campioni di CSF e liquidi sterili devono essere prelevati da un medico specializzato.
• Può anche essere una coltura pura di una tensione sospetta legata ai patogeni sopra menzionati.

Esecuzione della tecnica con campioni diretti

• I campioni devono essere centrifugati, quindi il surnatante viene scartato e il sedimento viene prelevato.
• Viene collocata una goccia di materiale centrifugato (sedimento) e una goccia di inchiostro cinese o nigrosina.
• Deve essere miscelato bene e copertina con una copertina, lasciando che la caduta si estenda come un bel film senza superare i bordi.
• Successivamente, la preparazione del microscopio è montata.
• Se la preparazione è molto buia, può essere diluita con acqua.

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Esecuzione della tecnica con ceppi di coltivazione

• Una parte molto piccola di un raccolto giovane viene presa con un ago seminato e si dissolve in una goccia di inchiostro cinese precedentemente posizionato su una diapositiva pulita.
• Una copertina è posizionata in cima.
• Si osserva nel microscopio 10x e quindi a 40x.

Puoi anche dissolvere una parte della colonia in acqua distillata e da lì prendere una goccia e mescolarla con l'inchiostro cinese. In questo modo, la preparazione non sarà così spessa, rendendo possibile l'osservazione delle strutture in isolamento. Se ci sono agglomerati, non sarà ben osservato.

Un'altra metodologia è la seguente:

• Metti un calo in sospensione a un'estremità della diapositiva.
• Metti una goccia di nigrosina alla stessa estremità e mescola.
• Con l'aiuto di un'altra diapositiva, estendere il campione come se stesse facendo uno striscio ematologico.
• Lascia asciugare e osservare sul microscopio.

Osservazione del microscopio

Innanzitutto deve essere focalizzato con il target 10x per avere un'ampia visione del campo. Successivamente, devi cercare se ci sono spazi chiari. Se ci sono, concentrati con 40x per vedere i dettagli.

Vantaggi

• È facile da eseguire.
• È una tecnica economica.
• Questo metodo non richiede che lo striscio sia fissato al calore o con sostanze chimiche, quindi vengono osservati microrganismi senza distorsioni.
• La preparazione dell'affresco non deve essere asciutta, quindi può essere osservata immediatamente, generando risultati rapidamente.

Svantaggio

• Una volta montato, si devono osservare immediatamente nuovi preparativi. Se sono autorizzati ad asciugarsi, non è più possibile osservarli e un nuovo.

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Stagno di tessuti con inchiostro cinese

Un'altra funzione che può adempiere all'inchiostro cinese è nei laboratori di patologia. Questo viene applicato in campioni di estratto chirurgicamente con lo scopo di contrassegnare i margini di resezione del tumore.

Il tessuto marcato viene spruzzato con acido acetico. Questo funge da mordente e impedisce all'inchiostro di uscire quando il tessuto è soggetto a elaborazione di routine per la preparazione della biopsia.

La procedura consiste nel bagnare il tessuto in alcool e xilene, e quindi incorporare in cera di paraffina. Questo marcatura guida il patologo quando si osserva il tessuto, indicando dove è il margine di resezione chirurgica o altro punto di interesse.

Riferimenti

1. Nigrosina. Recuperato da ES.Wikipedia.org.
2. Forbes, b., Sahm, d., Weissfeld, a. Diagnosi microbiologica di Bailey e Scott. Pan -American Editoriale S.A.