Colorazione grammo

La colorazione Gram è utile per visualizzare diversi tipi di batteri

Cosa è la colorazione di Gram?

IL Colorazione grammo È la tecnica di colorazione più semplice e utile nella microbiologia diagnostica per identificare i batteri. Questa tecnica è stata creata dal dottore danese Christian Gram nel 1884, che ha classificato i batteri in Gram -positivi (viola) e gram -negativi (rosa), secondo la composizione della parete cellulare.

La tecnica ha subito alcune modifiche di Hucker nel 1921 per stabilizzare i reagenti e migliorare la qualità della colorazione, quindi la colorazione di Gram è anche nota come Gram-Hucker.

Con questa tecnica è anche possibile. Così come la sua distribuzione nello spazio: in cluster, nella catena, isolata, in coppia, in tetradi, ecc.

Base

È una tecnica che presenta 4 passaggi fondamentali: colorazione, fissaggio con il mordente, scolorimento e assunzione. Pertanto, oltre a colorare i batteri, ti consente anche di differenziarli.

Violet Crystal è il primo colorante usato. Lo stesso ha un'affinità per il peptidoglicano e tingerà tutti i batteri presenti, successivamente collocato il Lugol, che agisce come mordente, cioè inducerà la formazione di complessi insolubili di vetro violetto/iodio/proteine ​​ribonucleari all'interno della cellula.

I batteri gram -positivi, con una parete peptidoglicana spessa, si formano più complessi (vetro viola/iodio), quindi saranno tinti di viola.

Influenza anche che il muro dei batteri gram -positivi contengono più acidi non attivi, che mostrano una grande affinità per gli agenti ossidanti (Lugol).

Gram -I batteri negativi hanno un sottile mantello di peptidoglicano, che rende i batteri meno complessi di gram -positivi.

Successivamente arriva il gradino dello scolorimento, dove i batteri gram -positivi e gram -negativi si comportano diversamente.

Gram -I batteri negativi contengono una membrana esterna ricca di lipopolisaccaridi che fa parte della sua parete cellulare. I grassi vengono distrutti dal contatto con l'alcol di acetone, quindi la membrana esterna è destabilizzata, il vetro viola è rilasciato.

Ecco come viene successivamente assunto con la safranina di base o il fucsin, prendendo il colore rosso.

Nel caso dei batteri positivi a Gram, resistono allo scolorimento perché la candeggina agisce chiudendo i pori, il che impedisce al complesso/iodio cristallino viola.

Pertanto, la colorazione con il vetro viola è stabile e non c'è posto per safranina o fucsin. Pertanto, questi batteri sono tinti intensi o viola.

Materiali

Il set di colorazione di Gram è composto da:

- Vetro viola.

- Lugol.

- Alcol di acetone.

- Safranina di base o fucsin.

Preparazione di coloranti e reagenti

Soluzione di cristallo viola

Soluzione a:

Violet Crystal - 2 Gr

95% - 20 cc alcol etilico

Soluzione B:

Ammonio ossalato - 0.8 gr

Acqua distillata- 80 cc

Per la preparazione finale del vetro viola, la soluzione a 1:10 deve essere diluita con acqua distillata e mescolare con 4 parti di soluzione B. La miscela viene immagazzinata per 24 ore prima di usarla. Viene filtrato in una bottiglia di colorazione ambra usando un filtro di carta.

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La quantità usata quotidianamente viene spostata su una bottiglia ambra con contagocce.

LUGOL IODINE

Pesare e misurare la quantità indicata di ciascun composto, come segue:

Cristalli di iodio - 1 gr

Potassio ioduro - 2 gr

Acqua distillata - 300 cc

Lo ioduro di potassio è sciolto a poco a poco in acqua e successivamente viene aggiunto lo iodio. La soluzione a una bottiglia ambra viene trasferita.

La quantità usata quotidianamente viene spostata su una bottiglia ambra più piccola con contagocce.

Disconsor

95% di alcol etilico - 50 ml

Acetone - 50 ml

È preparato in parti uguali. Coprire bene, perché tende a evaporare.

Botero in FUT.

Questa preparazione fornisce uno scolorimento del tempo moderato 5-10 sec., Ed è il più consigliato.

I principianti preferiscono utilizzare solo alcol etilico al 95%, dove lo scolorimento è più lento, da 10 a 30 secondi.

Mentre il più esperto può usare acetone puro, dove lo scolorimento si verifica molto rapidamente da 1 a 5 secondi.

Contrasto

Soluzione madre safranina

Safranine - 2.5 gr

95%di alcol etilico - 100 cc

Dopo aver pesato la quantità indicata di safranina, si dissolve a 100 cc di alcol etilico al 95%.

Dalla soluzione madre, viene preparata la soluzione di safranina di lavoro.

Per fare ciò, misurare 10 cc della soluzione madre, aggiungere 90 cc di acqua distillata per completare 100 ml.

Si consiglia di trasferire la quantità utilizzata quotidianamente in una bottiglia ambrata con goccia.

Microrganismi tinti debolmente con la colorazione di Gram-Hucker, come alcuni anaerobi, Legionella SP, Campylobacter SP E Brucella sp, Possono essere colorati molto meglio se la modifica apportata da Kopeloff alla colorazione di Gram-Hucker, chiamata colorazione Gram-Kopeloff fatta.

Questa tecnica cambia la tintura di safranina per Fuchsin di base. Con questa modifica, è possibile colorare efficacemente i suddetti microrganismi.

Deposito reagente

I coloranti preparati devono essere conservati a temperatura ambiente.

Preparazione del campione esteso alla colorazione

Un campione deve contenere almeno 10⁵ I microrganismi prima della sua osservazione sono probabilmente in uno striscio. Quelli estesi possono essere eseguiti dal campione diretto o dalle colture in terreni solidi o liquidi.

Quelli estesi devono essere uniformi, ben distribuiti e non molto spessi, per una migliore visualizzazione delle strutture presenti.

Grammo di campioni diretti

Grammo di urina senza centrifuga

L'urina viene miscelata e 10 µl sono posizionati su una diapositiva. L'osservazione di almeno un campo di batterio/immersione indica che c'è infezione.

Ciò significa che il raccolto avrà circa più di 100.000 ufc/ml (10⁵ UFC/ml) di urina nell'85% dei casi.

Questo metodo non è utile per i conteggi coloniali al di sotto di 100.000 ufc.

Grammo di CSF

Il CSF dovrebbe essere centrifuga, il surnatante viene rimosso e il sedimento si estende in una diapositiva. Questo liquido è sterile in condizioni normali. L'osservazione dei batteri indica l'infezione.

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Grammo di campioni respiratori

Il grammo espettorato, il lavaggio bronchiale o broncoalveolare, sebbene ci possa essere una varietà di microrganismi, guiderà sempre la diagnosi, oltre ad essere utile il tipo di cellula osservata.

Nel caso di Esputo, quello esteso con le parti più purulente del campione deve essere preparata.

Feci grammo

Non è consigliabile creare grammi a questo tipo di campioni, poiché non ha valore diagnostico.

Grammo di colture

Possono essere fatti in due modi, uno dalle colture liquide e un altro da colture solide.

Colture liquide

Dalle colture liquide è estremamente semplice: sotto gli accendini si prendono e collocati diversi arrosti del brodo torbido, dando movimenti circolari dal centro alla periferia, per distribuire uniformemente il materiale.

È consentito spontaneamente l'aria. Una volta asciutto, il materiale è fissato sul foglio con calore. Per fare questo, con l'aiuto di un morsetto passi il foglio da 3 a 4 volte attraverso la fiamma del Bunsen Accendino, attento a non bruciare il materiale.

Il foglio è consentito raffreddare e posizionato sul ponte di colorazione.

Colture solide

Per eseguire una colorazione di grammo estesa da una coltura solida, procedere come segue:

Prima di scegliere le colonie da prendere, è necessario preparare l'agnello slot, posizionando circa due gocce di soluzione salina fisiologica sterile.

Se la piastra di coltivazione originale contiene diversi tipi di colonie diverse, una colonia isolata di ognuna sarà scelta per eseguire il grammo. Ogni colonia verrà presa con la maniglia del platino per dissolverla nella soluzione salina precedentemente posizionata sulla diapositiva.

I movimenti circolari sono riportati dal centro alla periferia, per distribuire omogenea la colonia nella diapositiva.

È consentito spontaneamente l'aria. Una volta asciutto, il foglio è fissato con calore, come spiegato sopra (fiammeggia la fessura con l'accendino), facendo attenzione a non bruciare il materiale.

Questa procedura deve essere eseguita con ogni diverso tipo di colonia. L'ordine di ciò che si osserva, ad esempio:

Colonia 1: betahemolitico giallo colonia: cocco gram -positivi sono stati osservati nei cluster.

Colonia 2: Crema Colonia, senza emolisi: sono stati osservati cocobacilli gramnegativi.

Ogni foglio deve essere etichettato per sapere cosa stiamo osservando.

Tecnica

La tecnica di colorazione di Gram è estremamente semplice da eseguire e relativamente economica e non può mancare in un laboratorio di microbiologia.

Viene fatto come segue:

1. Impostare lo striscio con calore e posizionare sul ponte di colorazione.
2. Il foglio è completamente coperto di vetro viola di 1 minuto.
3. Lavare con acqua. Non asciugare.
4. Coprire il foglio con la soluzione Lugol, agire per 1 minuto. Lavare con acqua. Non asciugare.
5. Decorare 5-10 secondi con morbida agitazione nell'alcool acetone. O Posizionare il foglio in verticale e far cadere le gocce di decolorazione sulla superficie fino a quando non trascina il ricambio del cristallo viola. Non superare.
6. Lavare con acqua. Non asciugare.
7. Posizionare il foglio sul ponte di colorazione e coprire di 30 secondi con safranina (gram-hucker) o 1 minuto con Fuchsina di base (Gram-Kopeloff).
8. Lavare con acqua.
9. Eliminare spontaneamente nell'aria in posizione verticale.

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Una volta asciutto, posizionare 1 goccia di olio di immersione per osservarlo sotto il bersaglio di 100 volte al microscopio ottico.

Usi/applicazioni di colorazione grammo

- Questa tecnica consente di distinguere le differenze morfotintoriali della maggior parte dei batteri.

- I lieviti si distinguono anche con questa colorazione. Prendono il vetro viola, cioè sono tinti di grammo.

- È possibile distinguere i bacilli delle spore positive a gram, dove si osserva uno spazio chiaro all'interno del bacillo in cui si è formata l'endospora, sebbene le spore non siano ben colorate. Vengono utilizzate le spore di tintura, come Shaeffer-Fulton, come Shaeffer-Fulton.

- Aiuta a determinare il tipo di antibiotico che deve essere preparato.

Va notato che questa colorazione Non funziona Per colorare tutti i tipi di batteri, cioè ci sono casi in cui la colorazione non funziona.

In questi casi, i batteri che mancano di parete cellulare possono essere menzionati. Ad esempio: genere micoplasma, sferoplasto, Ureaplasma, L forme e protoplasti.

Inoltre, batteri con batteri ricchi di acidi micolici, come micobatteri, e batteri intracellulari, come le clamidie e i rickettsie.

È anche inefficace tingere la maggior parte dei batteri spirochemici.

Esistono batteri dello stesso genere che possono essere osservati nello stesso campione di Gram -positivi e come gram -negativo. Quando ciò accade, si chiama colorazione grammo variabile, che può essere dovuta all'alterazione di nutrienti, temperatura, pH o concentrazione di elettroliti.

Errori comuni

Decorare esageratamente

Esagerato nel passaggio di scolorimento può causare l'osservazione di microrganismi falsi gram.

Non aspettare abbastanza tempo di asciugatura per aggiungere l'olio di immersione

Questo errore fa formare i micel grassi che ostacolano l'osservazione delle strutture presenti. Ciò si verifica quando l'olio si unisce alle molecole d'acqua presenti nell'odore.

Investire l'ordine dei reagenti

Un errore come questo genererà batteri gram -negativi da visualizzare, cioè falsi gram -positivi.

Usa vecchie colture (solidi o liquidi)

Può causare la macchia di batteri Gram -Positivi. Ciò accade perché nelle vecchie colture è probabile che ci siano batteri morti o deteriorati, e in queste condizioni i batteri non mantengono il vetro viola.

Usa una soluzione Lugol molto vecchia

Nel tempo, Lugol perde le sue proprietà e il suo colore sta svanendo. Se viene utilizzato il reagente già degenerato, questo non risolverà bene il vetro viola, quindi esiste la possibilità di ottenere una visualizzazione di microrganismi falsamente gram.

Sfondo blu

Uno sfondo correttamente scolorito sarà rosso. Uno sfondo blu indica che lo scolorimento era insufficiente.

Riferimenti

1. Case-Rincón, g. (1994). Micologia generale. Università centrale del Venezuela.
2. Colorazione grammo. Preso da esso.Wikipedia.org.
3. González, m., González, n. (2011). Manuale di microbiologia medica. Direzione dei media e delle pubblicazioni dell'Università di Carabobo.