Fondazione, procedura e usi della coagulasi

IL Test di coagulasi È una tecnica di laboratorio che viene utilizzata per evidenziare la presenza dell'enzima di coagulasi. Questo enzima ha la proprietà del plasma coagulare. Loeb nel 1903 fu il primo a descrivere questo enzima.

Questo test viene eseguito su cocco positivi, catalasi positiva, consentendo i ceppi di Staphylococcus aureus Del resto dello stafilococchi, poiché è l'unico microrganismo di importanza clinica che lo produce.

Entrambe le immagini rivelano un test di coagulasi positivo. Fonte: Immagine a sinistra: Philippinjl [CC BY-SA 3.0 (http: // creativeCommons.Org/licenze/by-sa/3.0/]]. Immagine giusta: foto scattata dall'autore MSC. Marielsa Gil.

In questo senso, i membri della famiglia stafilococaee che danno questo test negativo sono spesso chiamati negativi di Staphylococcus coagulasi.

Ci sono alcuni ceppi diversi da S. aureola  che può produrre coagulasi, come Staphylococcus schleiferi spp coagulans, s. Hyicus, s. Intermedius e s. Delphini.

Tuttavia, i primi tre sono di importanza clinica a livello veterinario e raramente si trovano come agente causale delle infezioni umane, mentre S. Delphini Si trova solo in ambienti marini.

Inoltre, differiscono facilmente perché S. Hyicus E S. Intermedius Non fermentano il mannitolo e S. Schleiferi spp Coagulans non fermenta il maltosio, né il trehalosa, mentre S. aureola Sì fermenta questi carboidrati.

La presenza dell'enzima di coagulasi è stata legata alla virulenza dei ceppi.  Tuttavia, questa teoria è caduta, in considerazione del fatto che altre specie virulente di coagulasi negativa sono osservate in grado di produrre importanti infezioni.

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Base

Staphylococcus aureus Produce due tipi di coagulasi, uno che rimane collegato alla parete cellulare, chiamato anche fattore di agglutinazione o fattore reattivo della coagulasi (FRC) e un extracellulare che viene rilasciato in colture liquide. Ecco perché sono chiamati rispettivamente la United Coagulase e Free Coagulasi.

L'enzima di coagulasi deve il suo nome all'azione che produce. Ciò ha la capacità di trasformare il fibrinogeno in fibrina, creando un evidente coagulo quando è nel plasma, cioè questo enzima simula l'attività della trombina della cascata di coagulazione.

In effetti, una delle teorie più accettate è che la coagulasi unita reagisce con la coagulasi libera per attivare i fattori di coagulazione. Questa attivazione genera una sostanza che agisce in modo simile a come fa la protrombina, creando un composto con funzione di trombina.

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La differenza con la normale cascata di coagulazione è che questa reazione non ha bisogno della presenza di calcio e non è influenzata dall'eparina.

Per eseguire il test della coagulasi, è sufficiente affrontare un nuovo raccolto di stafilococco con un plasma di coniglio preferibilmente e quindi osservare la formazione o meno del coagulo.

Esistono tecniche specifiche per rilevare la coagulasi unita e la unita e la coagulasi gratuita allo stesso tempo.

Alcuni ceppi di S. aureola Danno un risultato positivo più rapido di altri. La velocità della formazione di coaguli è direttamente proporzionale all'attuale concentrazione di coagulasi.

La tecnica del test di coagulasi nella diapositiva rileva le coagule unite.

Procedura

-Test di coagulasi in supporto

Materiali

-Foglio di diapositive pulito

-Il plasma di coniglio preferibilmente, il plasma umano o per cavalli può anche essere usato. Il plasma può essere acquisito commercialmente liofilizzato e ricostituito quando verrà utilizzato o può essere usato fresco (recentemente preso). Un'altra alternativa praticabile è l'uso del fibrinogeno.

-Soluzione salina (0,85%) sterile (SSF).

Ottenere plasma fresco

Estrarre sangue venoso umano o animale. È possibile utilizzare uno dei seguenti anticoagulanti: EDTA, ossalato di calcio, eparina o citrato di sodio. Mescola bene e centrifuga. Rimuovere asetticamente il surnatante (plasma), senza globuli rossi e depositare in un tubo sterile.

Separazione al plasma. Fonte: foto scattata dall'autore: MSC. Marielsa Gil.

Plasma liofilizzato

Ricostituire come specificato dalla fiala del kit commerciale.

Fibrinogeno fresco

Da un plasma citrato, mescolare il plasma con una soluzione satura di cloruro di sodio. Permettere.

Scartare il surnatante, ricostituire il precipitato fino a 5 volte il suo volume con acqua distillata sterile. Aggiungi 5 unità di eparina per ogni ml di fibrinogeno. Salva.

Tecnica

In una diapositiva viene posizionata una goccia di soluzione salina e una goccia di plasma separatamente. Prendi con la maniglia platino 1 o 2 colonie pure del microrganismo per provare.

Mescolare il carico batterico nella caduta del plasma e ripetere l'operazione nella caduta SSF. Nota immediatamente i risultati. Un risultato positivo sarà quello in cui si osserva la formazione di un macroscopico agglutinato (precipitato bianco) dopo un minuto sul lato di caduta con plasma.

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La caduta di SSF serve come controllo negativo. Se si osserva l'agglutinazione con l'SSF, ciò significa che il microrganismo è auto-aglutina, essendo in grado di fornire risultati falsi positivi. In questo caso deve essere corroborato con il test del tubo.

Si consiglia inoltre di montare un controllo positivo con una tensione nota di S. aureola.   

Interpretazione

Agglutinazione entro 5-20 segni (forte test positivo).

Agglutinazione variabile tra 20 secondi e un minuto (test ritardato positivo).

Un certo grado di agglutinazione dopo un minuto (test dubbio). Si consiglia di ripetere il test o confermare con il metodo del tubo.

Non c'è agglutinazione (test negativo).

Risultato con SSF. Deve sempre dare negativo se il risultato del test è automaticamente.

-Test di coagulasi del tubo

Materiali

-Provetta sterile

-Plasma

-Maria Bath a 37 ° C.

Tecnica

Misurare con una pipetta sterile da 0,5 ml di plasma e posizionarla in un tubo di prova 12 x 75. Carica la maniglia del platino con 2-4 colonie pure per studiare da una coltura solida da 18 a 24 ore e dispararla nel plasma attentamente, mescolare e incubare a 37 ° C per 4 ore.

Esamina il tubo alla prima ora senza scuoterlo, solo inclinati delicatamente. Se non viene ancora osservato alcun coagulo, puoi continuare a osservare ogni 30 minuti fino a completare 4 ore. Se dopo 4 ore è ancora negativo, può essere lasciato fino a 24 ore ma a temperatura ambiente. Osservare e segnalare il risultato.

Sulla base dell'esperienza, alcuni microbiologi raccomandano di utilizzare 500 µL di una sospensione batterica da una coltura di 18 ore in un mezzo liquido per eseguire il test.

Apparentemente offre risultati più rapidi e più affidabili rispetto a quando le colonie di media solide vengono emulsionate, specialmente se il plasma umano ottenuto dalla banca del sangue è stato utilizzato.

L'uso di ceppi di un brodo aiuta a diluire la possibile presenza di anticorpi anti-stafilococcici umani nel plasma che possono inibire l'azione della coagulasi.

Interpretazione

Se un coagulo che copre tutto il liquido (coagulazione completa) o il coagulo, nulla nel liquido rimanente (coagulazione parziale) dovrebbe essere considerato come un test positivo.

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Se non si forma, cioè la sospensione è omogenea, il test è negativo.

-Test di coagulasi usando il fibrinogeno

Il fibrinogeno è usato proprio come il plasma e serve sia per il test del supporto che per il test del tubo. Procedere come descritto per il plasma e interpretare allo stesso modo.

Utilizzo

È usato per differenziare il Staphylococcus aureus di coagulasi negativa stafilococchi.

QA

Avere raccolti freschi di una tensione di S. aureola Da usare come controllo positivo. Puoi anche avere una tensione di S. epidermidis come controllo negativo.

Limitazioni

-Un test positivo non dovrebbe essere lasciato in incubazione per 24 ore, come il S. aureola produce fibrinolisina che dissolve il coagulo.

-Per un test affidabile, è necessario utilizzare il plasma fresco o appena ricostituito, nonché è importante usare colture batteriche fresche (da 18 a 24 ore). Questo evita falsi negativi.

-Il test deve essere eseguito congiuntamente con un controllo negativo e positivo.

-Alcuni supporti solidi possono interferire con il test della coagulasi. Non è consigliato.

-Se viene utilizzato il plasma citrato, si consiglia di posizionare 5 unità di eparina per ml di plasma per evitare falsi positivi. Questo perché alcuni diversi microrganismi da S. aureola Possono decomporre il citrato e fare coaguli al plasma. In questo caso è consigliabile fare grammo e un test di catalasi.

-È importante, nel test del tubo, monitorare la reazione ogni 30 minuti, poiché vi sono ceppi di S. aureola che producono alte concentrazioni di fibrinolisina e diluirà il coagulo di recente formazione. Evita falsi negativi.

-Durante il monitoraggio del test, il tubo deve essere evitato bruscamente, questo può distruggere l'inizio della formazione del coagulo che non verrà ripristinato, causando falsi negativi.

Riferimenti

1. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnosi microbiologica. 5 ° ed. Pan -American Editoriale S.A. Argentina.
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