Metodo Bradford Cosa è, principio, reagenti, usi

Lui Metodo Bradford È un metodo colorimetrico attualmente utilizzato per la rapida stima della concentrazione totale di proteine ​​nei campioni di sperimentazione biologica. È usato in numerosi campi di ricerca biologica, medica, veterinaria, agronomica, ecc.

È noto come "Bradford Method" perché è stato descritto per la prima volta da Marion Bradford nel 1976, nella sua pubblicazione intitolata Un metodo rapido e sensibile per la quantificazione delle proteine ​​in quantità di microgrammi usando il principio dell'Unione proteica-Youth.

Fotografia di una targa ELISA in cui i campioni si sono preparati per una quantificazione di Bradford (fonte: Helito, CC BY-SA 4.0, via Wikimedia Commons)

Dalla sua proposta, questo metodo è stato popolarmente reso popolare, in quanto è riconosciuto più sensibile di altri metodi di quantificazione delle proteine ​​(come Lowry e Biuret, per esempio); forma complessa più stabile ed è economico e facile da realizzare.

Inoltre, è stato dimostrato che i reagenti che usano hanno pochissime interferenze nelle misurazioni spettrofotometriche in condizioni diverse.

[TOC]

Principio del metodo

Il metodo di Bradford si basa sulla quantificazione dei cambiamenti di colore in una soluzione dovuta all'unione - in condizioni acide - delle molecole proteiche di un campione con le molecole di un colorante speciale: Coomassie Blue Blu brillante G250.

Quando questo colorante viene aggiunto a una soluzione proteica, si lega a queste molecole attraverso le forze elettrostatiche e questa reazione viene evidenziata come un colore marrone rossastro cambi in blu a blu.

Proteine ​​e aminoacidi

Proprio come il corpo è formato da molte cellule e acidi nucleici (come il DNA e l'RNA) sono formati da nucleotidi, le proteine ​​sono formate da sequenze ordinate di alcune molecole note come aminoacidi.

Un aminoacido è una molecola composta da un atomo di carbonio centrale a cui sono uniti 4 diversi gruppi chimici: un atomo di idrogeno, un gruppo carbossilico, un gruppo amminico e un gruppo o una catena laterale, che fornisce l'identità.

Esistono 20 aminoacidi comuni per tutte le proteine, che differiscono l'una dall'altra rispetto alle proprietà dei loro gruppi laterali: ci sono aminoacidi di base, acidi, polari, apolari, ciclici, aromatici, ecc.

Può servirti: Shelford's Tollerance Law: cosa è ed esempi

La somma delle caratteristiche di questi aminoacidi e l'ordine in cui si uniscono per formare la struttura proteica danno a ciascuna proteina una serie di particolari caratteristiche fisico -chimiche, sia per quanto riguarda il loro carico, la loro massa, la loro idrofobicità, tra gli altri.

Complesso tinta-proteina

Il metodo di Bradford, quindi, quantifica la presenza di residui di aminoacidi delle caratteristiche di base nei campioni biologici, in particolare aminoacidi come arginina, lisina e istidina, che sono quelli che sono più facilmente ospitati con Coomassie Blue.

Le variazioni di colore sono quantificate come variazioni nell'assorbanza dei campioni, che viene misurata usando uno spettrofotometro regolato a una lunghezza d'onda di 595 nm.

Cos'è l'assorbanza?

È anche noto come densità ottica e definisce la quantità di luce che viene assorbita da una soluzione. Questo assorbimento dipende dalla lunghezza d'onda della luce utilizzata per irradiare la soluzione, poiché non tutte le molecole sono in grado di assorbire la stessa lunghezza d'onda.

Questo fenomeno è stato riassunto in una legge nota come legge di Beer-Lambert, che stabilisce la relazione tra la diminuzione della quantità di luce che passa attraverso una sostanza e le proprietà di detta sostanza.

Ad esempio, quando una luce viene trasmessa attraverso una soluzione, esistono due misure di intensità: un'intensità incidente (prima di attraversare la soluzione) e un'intensità trasmessa (generalmente inferiore, che corrisponde alla frazione di luce che non è stata assorbita dalla soluzione).

La relazione tra i due valori è ciò che è noto come elaborazione e ha valori tra 0 e 1 o è espresso in termini percentuali.

L'assorbanza è correlata alla lavorazione del modo logaritmico e la legge di Beer-Lambert propone una relazione lineare tra l'assorbanza di una soluzione e la sua concentrazione, il suo coefficiente di estinzione molare e il coefficiente ottico della soluzione; L'equazione matematica che descrive questa legge è la seguente:

Può servirti: fauna dannosa: cause di proliferazione, conseguenze, controllo

A (assorbanza) = ε (coefficiente di estinzione molare) C (concentrazione) L (lunghezza del passaggio della luce)

La concentrazione di una soluzione viene calcolata eliminando detto sconosciuto dell'equazione ed eseguendo i calcoli pertinenti (c = a/εl)

Cos'è uno spettrofotometro?

È un dispositivo che viene utilizzato per quantificare la quantità di luce (a seconda della lunghezza d'onda) che assorbono le molecole in una soluzione o, in altre parole, la quantità di luce che passano.

Gli spettrofotometri funzionano emettendo un raggio di luce (visibile o ultravioletto) che passa attraverso un prisma (o un dispositivo noto come Monocromatore della rete di diffrazione) che lo scompone nelle diverse lunghezze d'onda che lo compongono, consentendo di "selezionare" una lunghezza particolare.

Questa luce viene passata attraverso uno speciale tubo che contiene il campione che viene analizzato e successivamente raggiunge un rilevatore che percepisce la quantità di luce che viene trasmessa da detto campione (che non è stato assorbito) che può essere osservato in seguito grazie a un "interprete" che ha un'interfaccia grafica.

The Dye: Coomassie Blue Blu brillante G 250

Il reagente più importante di questo metodo è, senza dubbio, il colorante usato per "contrassegnare" le proteine ​​nel campione. Bradford ha proposto il suo lavoro perché questa tintura esiste in due modi: uno rosso e uno blu. La forma rossa diventa la forma blu una volta che il colorante si lega a una proteina, formando un complesso.

Il complesso blu blu-proteina ha un coefficiente di estinzione molare molto elevato, con conseguente maggiore sensibilità per la quantificazione della concentrazione proteica nei campioni analizzati.

Reagenti

Sebbene la soluzione utilizzata per questo metodo di quantificazione sia generalmente commercializzata in contenitori chiusi, già preparato -il "Bradford Reactive" -, i principali reagenti utilizzati sono:

- Coomassie Blue Blu brillante G50 (0.01% w/v)

- Acido fosforico (8.5 % p/v)

- Etanolo (4.7% w/v)

Kit di quantificazione delle proteine ​​con il metodo di Bradford (fonte: Vivo Rolfe, CC BY-SA 4.0, via Wikimedia Commons)

Come in qualsiasi metodo e protocollo di quantificazione delle proteine ​​mediante metodi spettrofotometrici, è necessario disporre di una proteina "standard" o "standard" per eseguire a curva di calibrazione determinare i valori di assorbanza correlati a diverse concentrazioni di proteina; Viene utilizzato generalmente l'albumina sierica bovina.

Può servirti: agar cioccolato

Il metodo consiste nella miscelazione di determinati volumi dei campioni problema con alcuni volumi del reagente di Bradford; Attendere un paio di minuti per l'interazione della tintura-proteina e la modifica del colore è evidente e successivamente misurato e registra i valori di assorbanza per eseguire i calcoli successivi.

Usi/applicazioni

Il metodo di Bradford è uno dei metodi di quantificazione o stima della concentrazione proteica più utilizzata nel mondo, principalmente a causa del suo basso costo, alla velocità con cui si ottengono i risultati, alla grande stabilità tra la proteina e il colorante utilizzato, per la sua riproducibilità e la minima interferenza che i componenti dei reagenti utilizzati durante la misurazione hanno.

Il metodo viene utilizzato in centinaia di diverse applicazioni scientifiche per la determinazione delle proteine ​​in contesti diversi: fisiologico, citologico, immunologico, clinico, industriale (in particolare nell'industria alimentare), ecc.

Sperimentalmente, questo metodo è molto utile per:

• Monitorare la quantità di proteina contenuta nei volumi che sono progressivamente ottenuti da una colonna cromatografica (nelle colonne di affinità, scambio ionico, assorbimento, filtrazione del gel, tra gli altri) i.E. Analizzare le frazioni dei protocolli di purificazione delle proteine.
• Monitorare la quantità di proteina che viene caricata in un gel per l'elettroforesi.
• Stimare la quantità di proteina ottenuta in un sistema di sovraespressione.

Riferimenti

1. Bonjoch, n. P., & Tamayo, P. R. (2001). Quantificazione del contenuto proteico con il metodo Bradford. Nel manuale delle tecniche di ecofisiologia delle piante (PP. 283-295). Springer, Dordrecht.
2. Bradford, m. M. (1976). Un metodo rapido e sensibile per la quantificazione delle quantità di microgrammi di proteina usando il legame principale del giorno della proteina. Biochimica analitica, 72 (1-2), 248-254.
3. Kielkopf, c. L., Bauer, w., & Urbatsch, i. L. (2020). Dosaggio di Bradford per determinare la concentrazione di proteine. Cold Spring Harbor Protocols, 2020 (4), PDB-Prot102269.
4. Sapan, c. V., Lundblad, r. L., & Price, n. C. (1999). Tecniche di test della proteina colorimetrica. Biotecnologia e biochimica applicata, 29 (2), 99-108.
5. Walker, J. M. (Ed.). (millenovecentonovantasei). Il manuale dei protocolli proteici (Vol. millenovecentonovantasei). Springer Science & Business Media.