Fondazione, protocollo e applicazioni di immunofluorescenza

IL immunofluorescenza È una potente tecnica di immunomarcy che utilizza anticorpi uniti in modo covalente per molecole fluorescenti per identificare obiettivi specifici nei campioni di cellule fissati su un supporto solido.

Questa tecnica osservazione microscopica con specificità immunitaria, rendendo possibile l'osservazione di cellule viventi o morte che possono avere piccole quantità di antigeni. È ampiamente utilizzato sia nel campo della ricerca che nella diagnosi clinica di varie patologie.

Immunomarciness dei filamenti di actina nelle cellule cardiomiocita (fonte: PS1415 [CC BY-SA 4.0 (https: // creativeCommons.Org/licenze/by-sa/4.0)] via Wikimedia Commons)

Questa tecnica principalmente qualitativa (con alcune varianti quantitative), deve fare specificamente con la visualizzazione di un campione dal prodotto di un fluoroforo, che è una molecola fluorescente attaccata a un anticorpo e che è in grado di eccitarsi a una certa lunghezza d'onda.

Nel contesto cellulare è molto utile studiare la presenza/assenza e la posizione subcellulare delle proteine. La tecnica è stata utilizzata nei suoi inizi nel campo clinico per la diagnosi di virus come l'influenza e successivamente per molte altre malattie infettive.

È una tecnica di grande sensibilità e, con il corretto team di microscopia, può avere un'ottima risoluzione. Richiede, per la sua osservazione, l'uso di microscopi confocali o epifluorescenti.

Tuttavia, nonostante sia molto popolare, è possibile presentare alcuni importanti problemi riguardo all'ottenimento di fluorescenza non specifica che genera un certo "rumore" in background, il che spesso limita la lettura corretta dei risultati.

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Base

L'immunofluorescenza si basa sullo sfruttamento del fenomeno biologico della reazione di interazione tra un anticorpo e un antigene. Deve fare specificamente con la visualizzazione o il rilevamento di questa reazione quando entusiasmanti molecole fluorescenti a una lunghezza d'onda specifica.

Un anticorpo è una proteina immunoglobulina secreta da cellule B attive ed è specificamente generato contro un antigene, che può essere unita a grande affinità e specificità. L'immunofluorescenza utilizza immunoglobuline IgG, che si trovano solubili nel siero del sangue.

Gli anticorpi sono molecole fino a 950 kDa composte da due peptidi corti (luce) e due lunghezze sotto forma di "y" (pesante). Sia le catene leggere che pesanti sono divise in due domini: una variabile, in grado di riconoscere l'antigene e un'altra costante o conservata, caratteristica di ciascuna specie.

Gli antigeni sono definiti funzionalmente come molecole che possono essere riconosciute da un anticorpo e sono principalmente proteine. Quando un animale è esposto a un antigene, i linfociti del sistema immunitario vengono attivati, producendo anticorpi specifici contro di esso e funzionando come sistema di difesa.

Un antigene, come una proteina, ad esempio, può avere più di un epitopo o luogo di riconoscimento per un anticorpo, quindi il siero dell'animale esposto a un antigene può avere anticorpi policlonali contro diverse regioni della stessa proteina.

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L'immunofluorescenza, quindi, sfrutta la capacità di un animale di produrre anticorpi policlonali contro un antigene specifico per purificarlo e successivamente usarlo per il rilevamento dello stesso antigene in altri contesti.

Tra i coloranti o le molecole fluorescenti più utilizzate per alcune tecniche di immunofluorescenza ci sono la fluoresceina Isootiocianato (FITC), tetrametilrodamina-5 e 6 (Tritc) isocianato, molte cianine come Cy2, Cy3, Cy5 e Cy7 e coloranti chiamati Alexa Fluor®, come Alexa Fluor®448.

Protocollo

Il protocollo di immunofluorescenza varia a seconda di molti fattori, tuttavia e in generale, comprende una sequenza lineare di passaggi costituiti da:

• Preparazione di fogli e cellule
• Fissazione del campione
• Permeabilizzazione
• Blocco
• Immunoto o immunomarcaje
• Assemblaggio e osservazione

-Preparazione

Dei campioni

La preparazione dei campioni dipenderà dalla loro natura e dal tipo di esperienza da realizzare. Successivamente, verrà spiegato il caso più semplice, il che implica l'uso di cellule sospese.

Le cellule di sospensione, cioè in un terreno di coltura liquida, devono prima essere separate da questo mediante centrifugazione e quindi devono essere lavate con una soluzione tampone o "respingente" isosmotico, che conserva la sua integrità.

Normalmente viene utilizzato un tampone fosfato-salina noto come PBS, in cui le cellule sono risospensa.

Dei fogli

Anche i fogli utilizzati per l'osservazione microscopica, in cui le cellule saranno fissate per i corrispondenti trattamenti a valle, devono essere preparati attentamente.

Questi sono coperti o "sensibilizzati" con una soluzione di polisina, un polimero sintetico che fungerà da "colla molecolare" tra cellule e supporto solido, grazie all'interazione elettrostatica tra le cariche positive dei loro gruppi amminici e i carichi negativi di proteine cellule.

Fissazione del campione

Questo processo consiste nell'immobilizzare le proteine ​​che si trovano nell'interno cellulare per mantenere intatta la loro posizione spaziale. Le molecole utilizzate dovrebbero essere in grado di attraversare tutti i tipi di membrane cellulari e formare frame con proteine ​​covalenti.

La formaldeide e la paraformaldeide, la glutaraldeide e persino il metanolo sono ampiamente utilizzati, con cui i campioni di cellule sono incubati per un certo tempo e quindi lavarli con una soluzione tampone isosmotica.

Dopo la fissazione delle celle, continua a unirsi ai fogli precedentemente sensibilizzati con polisina.

Permeabilizzazione

A seconda del tipo di test eseguito, sarà necessario permeabilizzare o meno le cellule in studio. Se ciò che viene richiesto è conoscere la posizione, la presenza o l'assenza, di una certa proteina sulla superficie cellulare, la permeabilizzazione non sarà necessaria.

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D'altra parte, se si desidera conoscere la posizione di una proteina all'interno dell'interno cellulare, la permeabilizzazione è indispensabile e consisterà in campioni di incubazione con Triton X-100, un detergente in grado di permeabilizzare le membrane cellulari.

Blocco

Un passo fondamentale in tutte le tecniche immunologiche è bloccare. In questa fase della procedura, il blocco consiste nella copertura, nei fogli sensibili, tutti i siti con molecole di polieesina a cui non venivano rispettate le cellule. Cioè, impedisce qualsiasi unione non specifica.

Normalmente per bloccare le soluzioni con albumina di siero di latte (BSA) sono utilizzate nel buffer PBS e i migliori risultati sono ottenuti più a lungo è il tempo di incubazione con questa soluzione. Dopo ogni passaggio, incluso il blocco, è necessario rimuovere la soluzione rimanente mediante il lavaggio.

Immunoto o immunomarcaje

La procedura di immunomaria o immunomarcinezza dipenderà principalmente se è un'immunofluorescenza diretta o indiretta (vedi più avanti).

Se è un'immunofluorescenza primaria o diretta, i campioni saranno incubati con gli anticorpi desiderati, che devono essere accoppiati ai coloranti fluorescenti. La procedura di incubazione consiste nel fare una diluizione dell'anticorpo in una soluzione che conterrà anche la BSA ma in una proporzione inferiore.

Quando il caso è quello di un'immunofluorescenza secondaria o indiretta, è necessario effettuare due incubazioni consecutive. Prima con gli anticorpi desiderati e poi con gli anticorpi che sono in grado di rilevare le regioni costanti delle immunoglobuline primarie. Sono questi anticorpi secondari che sono uniti covalentemente ai fluorofori.

La tecnica è molto versatile, consentendo segni simultanei di più di un antigene per campione, purché abbiano anticorpi primari accoppiati a diversi fluorofori, in caso di immunofluorescenza diretta.

Per i segni simultanei nell'immunofluorescenza indiretta è necessario.

Come il blocco, l'incubazione con anticorpi dà risultati migliori, maggiore è il tempo di questo. Dopo ogni passo è necessario lavare gli anticorpi in eccesso che non si sono uniti ai campioni e nell'immunofluorescenza secondaria è necessario bloccare prima di aggiungere l'anticorpo secondario.

Alcune tecniche usano altri coloranti che non hanno nulla a che fare con l'immunomarietà, come la colorazione del DNA nucleare con fluoroforo DAPI.

Assemblaggio e osservazione

Durante il tempo di incubazione finale con i fluorofori è necessario che i campioni rimangono al buio. Per l'osservazione del microscopio è comune.

Ragazzi

Riepilogo grafico dell'immunofluorescenza diretta e indiretta (Fonte: Westhayl618 [CC BY-SA 4.0 (https: // creativeCommons.Org/licenze/by-sa/4.0)] via Wikimedia Commons)

Immunofluorescenza diretta o primaria

Ha a che fare con il rilevamento di antigeni attraverso l'uso di anticorpi fluorescenti. Il principale vantaggio dell'uso di questa tecnica è la sua velocità, tuttavia, nel processo possono verificarsi molti casi di unione non specifica, in particolare quando si studiano sieri umani, perché sono ricchi di anticorpi molto eterogenei.

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Immunofluorescenza indiretta o secondaria

È anche noto come tecnica "sandwich" e questo implica lo sviluppo della tecnica in due passaggi. Il primo ha a che fare con l'uso di un anticorpo non fluorescente e la sua unione con l'antigene di interesse.

Contro la regione costante di questo primo anticorpo (che ora fungerà da antigene) un secondo anticorpo in grado di riconoscerlo viene utilizzato, che è associato a una molecola fluorescente.

La comparsa di un segnale fluorescente sarà il risultato del riconoscimento specifico tra il primo anticorpo non fluorescente e l'antigene di interesse; La presenza di quel primo anticorpo condiziona quella del secondo, che è etichettata e grazie a cui si può determinare la presenza o l'assenza dell'antigene.

Nonostante sia una tecnica che consuma molto più a lungo dell'immunofluorescenza diretta (poiché include una fase di più incubazione), questa tecnica non implica la progettazione di un anticorpo fluorescente per ogni antigene che viene studiato, che risulta, in termini economici, più praticabile.

Inoltre, è una tecnica più sensibile in termini di amplificazione del segnale, poiché più di un anticorpo secondario può unirsi alla regione costante dell'anticorpo primario, amplificando così l'intensità del segnale fluorescente.

Applicazioni

Come notato in precedenza, l'immunofluorescenza è una tecnica estremamente versatile, a cui sono state somministrate moltiplicità di usi nei campi scientifici e clinici. Può essere usato per rispondere a domande ecologiche, genetiche e fisiologiche riguardo a molti organismi.

Tra le applicazioni cliniche, viene utilizzato per la diagnosi diretta di alcune malattie dermatologiche, sia utilizzando l'immunofluorescenza diretta o indiretta sul tessuto epiteliale dei pazienti studiati.

Le tecniche di immunofluorescenza sono state disposte in organismi unicellulari come lieviti per visualizzare microtubuli intranucleari e citoplasmatici, actina e proteine ​​associate, filamenti a 10 nm e altri costituenti del citoplasma, membrana e pareti cellulari.

Riferimenti

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