Caratteristiche DAPI (4 ', 6-diamidino-2-Fenilindolo), Fondazione, Uso

Lui DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo) È un colorante che dalla sua proprietà fluorescente funge da marcatore, essendo ampiamente utilizzato nella tecnica di microscopia a fluorescenza o a flusso di citometria, tra gli altri. La fluorescenza che emette è blu brillante, la sua eccitazione si verifica tra 455-461 nm (luce UV).

Il colorante Dapi può attraversare la membrana cellulare dalle cellule morte con grande facilità. Puoi anche tingere i nuclei cellulari vivi, ma in questo caso la concentrazione deve essere maggiore.

Struttura chimica del disst fluorescente. Fonte: Immagine: File: DAPI.SVG è una versione vettoriale di questo file. Dovrebbe essere usato al posto di questa immagine raster quando non inferiore/Richard Wheeler (Zephyris) [CC BY-SA 3.0 (http: // creativeCommons.Org/licenze/by-sa/3.0/)] immagine modificata

Il colorante è in grado di accedere al DNA cellulare attraverso il quale ha un'affinità speciale, unendosi con grande avidità alle basi di adenina e azoto di timina. Per questo motivo è molto utile in alcune tecniche di biologia molecolare.

Questo composto appartiene al gruppo di coloranti indoli e ha dimostrato di avere una maggiore sensibilità al DNA rispetto al bromuro di etidio e allo ioduro propido, in particolare sui gel di agarosio.

L'uso di questo colorante fluorescente è molto ampio, poiché è utile per: studiare i cambiamenti nel DNA nei processi apoptotici (morte cellulare) e quindi rilevare le cellule in questo processo; Per foto di footprint del DNA (stampa fotografica del DNA); studiare la contaminazione batterica; o per visualizzare la segmentazione nucleare.

È stato anche usato nello studio delle bande cromosomiche, nella rilevazione del DNA di Mycoplasmas sp, Nell'interazione del DNA-proteina, nella colorazione e nel conteggio delle cellule mediante immunofluorescenza e persino coloranti polline maturi.

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Caratteristiche

DAPI è l'abbreviazione del suo nome chimico (4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo). La sua formula molecolare è C₁₆H_quindiciN_5. Ha un peso molecolare di 350,3. Vicino alla gamma di luce UV (da 345 a 358 nm) si verifica la massima eccitazione del complesso DAPI-ADN, mentre l'emissione massima di fluorescenza si verifica tra 455-461 nm.

Questo colorante è caratterizzato dall'essere una polvere gialla, ma le strutture contrassegnate da questo fluoroforo emettono una luce blu brillante.

È un composto solubile in acqua, tuttavia, per accelerare la sua dissoluzione, è possibile applicare un po 'di calore. Può essere diluito con PBS ma non dissolversi direttamente in questo.

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Una volta che il colorante è stato preparato, deve essere immagazzinato nell'oscurità, cioè protetto dalla luce, a una temperatura di 2 a 8 ° C (frigorifero). In queste condizioni, il colorante è stabile per più di 3 settimane o mesi.

Se la luce è protetta ma la sua stabilità viene lasciata a temperatura ambiente a 2 o 3 settimane, ma esposta alla luce diretta il deterioramento è molto veloce. Se vuoi risparmiare per molto più tempo, puoi refrigerare a -20 ° C distribuito in aliquote.

Base

Questa colorazione si basa sulla generazione di un'assunzione nucleare nelle principali tecniche di biologia molecolare, come: citometria a flusso, microscopia a fluorescenza e colorazione di cromosomi metafasici o nuclei di interfaccia, tra gli altri.

Questa tecnica si basa sulla grande affinità che il colorante ha per le basi azotate (adenina e timina) contenuta nel materiale genetico (DNA) nel solco minore. Mentre a livello citoplasmatico lascia molto poco il fondo.

Quando si verifica l'unione del colorante fluorescente nelle regioni di adenina e timina del DNA, la fluorescenza aumenta in modo significativo (20 volte di più). Il colore che emette è blu brillante. Va notato che non vi è alcuna emissione di fluorescenza quando si lega alle coppie di basi GC (guanina-citosina).

È importante evidenziare che sebbene abbia anche un'affinità per l'RNA, non causa un problema, poiché il maggiore grado di emissione di energia di questa molecola si verifica ad un'altra lunghezza d'onda (500 nm), a differenza del DNA che lo fa a 460 nm. Inoltre, l'aumento della fluorescenza una volta collegato all'RNA è solo del 20%.

Il DAPI è usato più per tingere le cellule morte (fisse) che vivi, poiché è necessaria una concentrazione molto più elevata del colorante, questo è perché la membrana cellulare è molto meno permeabile al DAPI quando è viva.

Il colorante DAPI può essere utilizzato in combinazione con fluorofori rossi e verdi per ottenere un'esperienza multicolore.

Utilizzo

Il DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo) è un eccellente fluoroforo ed è quindi ampiamente utilizzato in varie tecniche e per vari scopi. L'uso di DAPI è spiegato di seguito nelle tecniche principali.

Citometria a flusso

I ricercatori Gohde, Schumann e Zante nel 1978 furono i primi a usare e proporre il DAPI come fluoroforo nella tecnica della citometria a flusso, avendo un grande successo a causa della loro elevata sensibilità da parte del DNA e della sua alta intensità nell'emissione di fluorescenza.

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L'uso di DAPI in questa tecnica, consente lo studio del ciclo cellulare, la quantificazione delle cellule e la colorazione delle cellule viventi e morte.

Sebbene ci siano altri coloranti, come bromuro di etidio, ossido di hoechst, arancione acridina e ioduro di propidio, il DAPI è uno dei più usati per essere più fotoestabili di quelli sopra menzionati.

Per questa tecnica è necessario. Il campione è centrifugato e il surnatante è scartato.

Mentre il tempo passa il colorante DAPI con un tampone di colorazione (Foxp3 di Biolegend) a 3 µm.

Centrifughe il campione, scartare il surnatante e quindi coprire con 1 ml di soluzione DAPI per 15 minuti a temperatura ambiente.

Porta il campione al citometro a flusso con il laser giusto.

Microfluorometria a flusso

Un'altra tecnica in cui viene utilizzato il DAPI è nella micro-fluorometria del flusso insieme a un altro fluoroforo chiamato mitramico. Entrambi sono utili per quantificare.

Ibridazione Sul posto 

Questa tecnica utilizza sostanzialmente le sonde del DNA contrassegnate con un colorante fluorescente che può essere il DAPI.

Il campione richiede di essere trattato con calore per denaturalizzare il DNA di classe due e trasformarlo in due catene monocypenarie. Successivamente, è ibridato con una sonda DNA dnazzata marcata con DAPI che ha una sequenza di interesse.

Successivamente, viene lavato per eliminare ciò che non era ibrido, viene utilizzato un contrasto per visualizzare il DNA. Il microscopio a fluorescenza consente l'osservazione della sonda ibridata.

Questa tecnica ha lo scopo di rilevare sequenze specifiche nel DNA cromosomico, essendo in grado di diagnosticare determinate malattie.

Queste tecniche cito-molecolari sono state utili per determinare i dettagli nello studio dei karyotipi. Ad esempio, ha evidenziato le regioni ricche di coppie di basi di adenosina e timina chiamate regioni eterocromatiche o bande di DAPI.

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Questa tecnica è ampiamente utilizzata per lo studio dei cromosomi e della cromatina nelle piante e negli animali, nonché nella diagnosi di patologie prenatali ed ematologiche nell'uomo.

In questa tecnica, la concentrazione di DAPI raccomandata è di 150 ng/ml per un tempo di 15 minuti.

Le vetrini già montate dovrebbero essere protette dalla luce a 2-8 ° C.

Colorazione dell'immunofluorescenza

Le cellule sono fissate con paraformaldeide al 4%. Se verranno utilizzati altri coloranti, il DAPI viene lasciato alla fine come assunzione e sono coperte le celle con soluzione PBS per 15 minuti. Mentre trascorre il tempo, preparare la soluzione DAPI diluente con PBS, in modo che la concentrazione finale sia di 300 µM.

Quindi il PBS in eccesso viene estratto e coperto con DAPI per 5 minuti. Lavare più volte. Il foglio è osservato in un microscopio a fluorescenza sotto il filtro corretto.

Foglio di sicurezza

Questo composto deve essere manipolato con cura, perché è un composto che ha proprietà mutagene. Il carbone attivo viene utilizzato per eliminare questo composto di soluzioni acquose che verranno scartate.

I guanti, la veste e le lenti di sicurezza dovrebbero essere utilizzati per evitare incidenti con questo reagente. Se si verifica un contatto o un contatto mucoso, è necessario lavare l'area con abbastanza acqua.

Non dovresti mai piogni su questo reagente con la bocca, usa i propipeti.

Non contaminare il reagente con gli agenti microbici, poiché ciò comporterà risultati errati.

Non diluire il colorante DAPI più di quanto raccomandato, poiché la qualità della colorazione diminuirà considerevolmente.

Non esporre il reagente alla luce diretta o mantenere il calore perché diminuisce la fluorescenza.

Riferimenti

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