Brodo di urea cosa è, fondazione, preparazione, usi

Lui Brodo di urea È un terreno di coltura liquida, usato per dimostrare la presenza dell'enzima ureasa in alcuni microrganismi. Ureasa è un enzima microbico che si verifica in modo costitutivo, cioè è sintetizzato indipendentemente dall'essere il substrato su cui agisce.

La funzione di ureasa è correlata alla decomposizione dei composti organici. Non tutti i microrganismi sono in grado di sintetizzare questo enzima, quindi la sua determinazione in laboratorio consente di identificare determinati ceppi batterici e persino distinguere tra le specie dello stesso genere.

Esistono due tipi di test dell'urea: Stuart e Christensen. Differiscono nella loro composizione e sensibilità. Il primo è speciale per mostrare una grande quantità di ureasa prodotta dalle specie del genere proteico.

Il secondo è più sensibile e può rilevare piccole quantità di ureasa ultimamente da altri generi batterici, come Klebsiella, Enterobacter, Staphylococcus, Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus, Helicobacter e Mycobacteriumite.

Il brodo di urea di Stuart è costituito da urea, cloruro di sodio, fosfat di dipotassio.

Mentre il brodo di Christensen o l'impugnatura dell'urea sono composti da peptonas, cloruro di sodio, fosfato monopotásico, glucosio, urea, rosso fenolo, acqua distillata e agar. Quest'ultimo solo se è il mezzo solido.

Base

L'enzima ureasa idrolizza l'urea per formare anidride carbonica, acqua e due molecole di ammoniaca. Questi composti reagiscono per formare il prodotto finale chiamato carbonato di ammonio.

Brodo di urea de stuart

Il brodo di urea di Stuart è più tamponato con un pH di 6,8. Pertanto, il microrganismo deve essere in grado di formare grandi quantità di ammonio per trasformare il rosso di fenolo. Il pH deve salire sopra 8.

Pertanto, il brodo di urea di Stuart è selettivo per le specie Proteus, dando risultati positivi in ​​24-48 ore di incubazione e non è efficace per i batteri che producono poche quantità di ureasa o che idrolizzano lentamente l'urea.

Questo perché le specie Proteus sono in grado di usare l'urea come sorgente di azoto. D'altra parte, altri batteri che producono ureasa necessitano di una fonte aggiuntiva.

Tuttavia, Pérez et al. (2002) hanno determinato che il brodo di urea di Stuart era efficiente come l'agar di urea di Christensen, per determinare l'ureasa nei ceppi di lievito della candida.

Gli autori dello studio affermano di aver ottenuto una coincidenza al 100% con entrambi i media (Stuart e Christensen) incubando per 24 e 48 ore; Facendo l'eccezione che i ceppi che sono riusciti a trasformare i media in un forte colore rosa-fucsia hanno preso come positivo.

Questo esplicativo è necessario, dal momento che Lodder (1970) ha affermato che quasi tutti i lieviti riescono a posizionare la cornice dell'urea di Christensen per pallinare Rosado. Questo perché possono idrolizzare l'urea in quantità minime e alla formazione di ammine mediante decarbossilazione ossidativa degli aminoacidi superficiali. Questo non dovrebbe essere interpretato come positivo.

Brodo di urea o agar di Christensen

Il brodo di urea o l'agar di Christensen è meno tamponato, essendo in grado di rilevare piccole quantità di ammonio. Inoltre, questo mezzo è arricchito con peptonas e glucosio. Questi composti fanno sviluppare altri microrganismi che producono ureasa che non crescono nel brodo Stuart.

Allo stesso modo, il test dell'urea di Christensen offre risultati più rapidi, specialmente per Proteus, essere in grado di dare fortemente positivo in soli 30 minuti come tempo minimo e fino a 6 ore come massimo.

Il resto dei microrganismi di produzione di Ureasa riesce a trasformare leggermente il colore dell'ambiente dopo 6 ore e fortemente dopo 24, 48, 72 ore o più, e persino alcuni ceppi possono dare reazioni deboli dopo 5 o 6 giorni.

Interpretazione di entrambi i media (Stuart e Christensen)

Il mezzo è originariamente giallo-arancio e una reazione positiva trasformerà il colore dalla-fucsia medio a rosa. L'intensità del colore è direttamente proporzionale alla quantità di ammonio prodotto.

Una reazione negativa lascerà il colore originale ad eccezione dei lieviti, che può dare un rosa pallido con il mezzo di urea di Christensen.

Preparazione

Brodo di urea de stuart

Pesare i grammi necessari in base alle indicazioni della casa commerciale. Sciogliere in acqua distillata preferibilmente sterile.  Non usare il calore per dissolversi, perché l'urea è sensibile al calore.

Viene utilizzato per sterilizzare il metodo di filtrazione della membrana. Per questo, viene utilizzato un filtro Milliting con pori di diametro 0,45 µ. Non utilizzare l'autoclave. Una volta filtrata la soluzione, è distribuita in tubi sterili. Per ottenere risultati affidabili, tra 1,5 ml deve essere trasferito come importo minimo a 3 ml come quantità massima per tubo.

Tieniti in frigo e temperamento prima di usare.

Se il metodo di filtrazione non è disponibile, il mezzo deve essere utilizzato immediatamente per ottenere risultati affidabili.

Un altro modo per preparare il brodo di urea di Stuart è il seguente:

Alcune case commerciali vendono il mezzo di base per il test dell'urea, esclusi l'urea.

L'importo indicato dalla casa commerciale sta pesando. Si dissolve in acqua distillata e sterilizzato nell'autoclave a 121 ° C per 15 minuti. Lasciar riposare un po 'e quando il mezzo è caldo 100 ml di una soluzione di urea preparata al 20% e il filtro per filtrazione viene aggiunta.

È distribuito in tubi sterili, come descritto sopra.

Brodo di urea o agar di Christensen

-Preparazione della soluzione di urea

Pesare 29 gr di urea disidratata e dissolversi in 100 ml di acqua distillata. Utilizzare il metodo di filtrazione per sterilizzare. Non autoclavate.

-Agar di base di urea

Sciogliere 24 gr di base disidratata in 950 ml di acqua distillata. Sterilizzare in autoclave a 121 ° C per 15 minuti. Lasciare riposare fino a raggiungere una temperatura di 50 ° C e aggiungere l'urea precedentemente preparata in modo asettico.

Versare da 4 a 5 ml in tubi sterili e inclinarsi fino a quando non si solidificano. Un picco a flauto lungo deve essere.

Questo mezzo può anche essere preparato in forma liquida.

Applicazioni

Il test dell'urea è estremamente efficace per distinguere il genere Proteus dagli altri generi della famiglia Enterobacteriaceae, data la rapida reazione fornita da Proteus.

Se viene utilizzata la composizione di Christensen, il test aiuta a distinguere tra le specie dallo stesso genere. Per esempio, S. Haemolyticus e s. Warneri sSU Staphylococcus Coagulasi negativa e betahemolitica, Ma differiscono in cosa S. Haemolyticus È negativo e S. Warneri È urea positiva.

D'altra parte, McNulty ha usato con successo il 2% di brodo di urea di Christensen per studiare la presenza di Helicobacter pylori Nei campioni di biopsia prelevati dalla mucosa gastrica (regione antrale).

La presenza di H. Pylori È evidenziato con un test di urea positivo. La durata per osservare i risultati è direttamente proporzionale alla quantità di microrganismi presenti.

Come si può vedere, è un metodo semplice per la diagnosi di Helicobacter pylori Nelle biopsie gastriche.

Infine, questo test è utile anche per differenziare le specie dai generi Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus e Micobatteri.

Test di urea seminata

I due metodi richiedono un forte inoculo microbico per ottimizzare i risultati. Le colonie batteriche sono preferibilmente tratte dall'agar ematico e lieviti dell'agar di Sabouraud, ad eccezione di alcune eccezioni. L'inoculo è emulsionato nell'ambiente liquido.

Per il brodo di urea di Stuart, 37 ºC viene incubato per 24-48 ore, sapendo che sta cercando solo ceppi del genere proteico quando il ceppo è un batterio. Per i lieviti è possibile incubare a 37 ° C o a temperatura ambiente per 24-48 ore di incubazione.

Nel caso del brodo di urea di Christensen, 37 ºC è incubata per 24 ore. Se il test è negativo, può essere incubato fino a 6 giorni. Se il test fornisce positivo prima delle 6 del mattino, indica che è un ceppo del genere proteico.

Nel caso dell'agar di urea di Christensen, la cornice dell'agar è fortemente inoculata, senza foratura. Il brodo è incuba e interpreta allo stesso modo.

QA

Per testare il mezzo è possibile utilizzare i controlli dei controlli, come Proteus mirabilis ATCC 43071, Klebsiella pneumoniae  ATCC 7006003, Escherichia coli ATCC 25922 e Salmonella typhimurium.  I primi due devono dare risultati positivi e gli ultimi due risultati negativi.

Riferimenti

1. Britania Laboratories. Christensen Media (Urea Base Agar). Disponibile su: Britaniab.com