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Lui Biureto È un reagente utilizzato per la determinazione delle proteine ​​a catena lunga e a catena corta. È particolarmente usato nell'area della chimica analitica e dell'uroanalisi per studiare la concentrazione di proteine ​​totali di siero, plasma e urina.

I valori delle proteine ​​possono essere aumentati o diminuiti in alcune patologie. Le immagini di ipoproteinemie sono generalmente presentate in pazienti con malattia renale, in malnutriti e in pazienti con infezioni croniche.

Struttura chimica del complesso formato nel test del biureta positivo della reazione del biuret. Fonte: Yikrazuul [dominio pubblico]/Flickr

Mentre l'iperproteinemia è osservata in patologie come il mieloma multiplo, il lupus eritematoso sistemico, l'endocardite batterica, la meningite batterica, la macroglobulinemia waldenstrom, tra gli altri.

D'altra parte, la presenza di proteine ​​nelle urine è dovuta alla filtrazione dell'albumina da parte del rene. Questo è un comportamento patologico che deve essere studiato.

In questo senso, il biureto è molto utile, poiché consente di quantificare la presenza di proteine ​​sieriche, plasma, urina, tra molti altri campioni.

Anche il biureto può essere usato per studiare la presenza e la concentrazione di proteine ​​in campioni di composizione sconosciuti o sconosciuti. Pertanto, è ampiamente utilizzato nell'area di ricerca.

Il test Biuret si basa sul rilevamento di collegamenti peptidici. Il test è riportato in mezzo alcalino. Il campione deve contenere almeno due collegamenti peptidici in modo da poter formare un complesso di colori a potenza viola. Il complesso è formato dall'unione dei collegamenti e dall'ione del rame.

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Base

Il reagente Biuret è costituito da idrossido di potassio, solfato cuprico e sodio e potassio tartrato. L'idrossido di sodio viene utilizzato per alcalizzare l'ambiente, poiché questa condizione è indispensabile per la reazione.

Sostanze che reagiscono con le proteine ​​sono solfato cuprico, mentre il sodio tartrato ha la funzione di non consentire la formazione di idrossido di rame, che tende a precipitare e interferisce con la reazione.

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Se nel campione ci sono sostanze che hanno legami peptidici (polipeptidi o proteine) il test darà positivo.

Una reazione viene interpretata come positiva quando la soluzione diventa viola. Il colore è prodotto dalla formazione di un complesso tra almeno due legami peptidici che hanno il gruppo CO-NH e le attuali cationi cupric.

Il complesso viola può essere formato in due modi: uno è dovuto alla perdita di protoni dei gruppi di mezzo che si legano al metallo (ruvido) e l'altro dall'unione di elettroni di ossigeno e azoto che sono liberi e si legano con il rame.

Questa reazione può variare in intensità e colore a seconda del tipo di proteina.

Il test può essere eseguito qualitativamente o quantitativamente. Nella forma qualitativa è riportato come positivo o negativo. Mentre nella forma quantitativa la concentrazione può essere misurata con il metodo spettrofotometrico.

La reazione viene letta tra 540-560 nm. L'intensità del colore è direttamente proporzionale alla concentrazione di collegamenti peptidici nel campione.

Reagenti

-Idrossido di sodio (NaOH) al 20%

-1% di solfato cuprico pentaidrato (CUO₄. 5h₂O)

-Sodio misto di sodio e tetraidrato potassio tartrato (knac₄H₄O₆· 4h₂O)

Stabilità del reagente Biuret

-Deve essere mantenuto in refrigerazione.

Procedura

Tecnica

-Posizionare 100 µl del campione o il modello da analizzare in un tubo di prova.

-Aggiungi 2 ml di idrossido di sodio.

-Mescolare molto bene.

-Aggiungi 5 ml di reagente Biuret.

-Mescolare e lasciare 25 minuti a temperatura ambiente, coprire e proteggere dalla luce.

-Osservare la formazione o meno di colore e misura spettacotometricamente.

Curva di calibrazione

Per eseguire la curva di calibrazione puoi usare l'albumina bovina sierica come motivo. Vengono preparate diverse concentrazioni. Ad esempio 25, 50, 75, 100, 125 e 150%.

La reazione è montata con tutte queste concentrazioni note e l'assorbanza viene letta a una lunghezza d'onda di 540 nm. Con i dati delle concentrazioni note e le letture assorbenti viene eseguita la curva di calibrazione.

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In ogni determinazione o molti campioni elaborati è consigliabile. Come modello di calibrazione è possibile utilizzare l'albumina bovina sierica 0,1-2 mg/ml.

Le misurazioni sono effettuate in uno spettrofotometro da 540 nm.

La linearità è soddisfatta fino a una concentrazione di 12 g/dl.

Interferenza

Sostanze che interferiscono nel test Biuret

Sebbene non sia molto frequente, va notato che durante l'esecuzione di questo test alcune sostanze possono interferire. Ad esempio, la presenza di ammonio può inibire la formazione di colori.

Allo stesso modo, altre sostanze potrebbero assorbire la stessa lunghezza d'onda, come alcuni pigmenti.

D'altra parte, è possibile generare un'interferenza quando un'altra sostanza diversa dal collegamento peptidico forma un complesso con sale metallico. Esempio: alcuni carboidrati e alcuni lipidi.

Nel caso in cui lo mostri per analizzare un qualche tipo di precipitato, deve essere filtrato o centrifugato prima di impostare il test.

Sostanze che non interferiscono nel test Biuret

Il test non è influenzato dalla presenza di:

-Bilirubina fino a una concentrazione di 20 mg/dl.

-Emoglobina a una concentrazione di 750 mg/dl.

-Destrano a una concentrazione di 30 g/l.

-Trigliceridi fino a una concentrazione di 4000 mg/dl.

Vantaggi

-È un semplice metodo di esecuzione.

-È un test economico.

-Ha un'elevata specificità delle proteine.

-Poche interferenze.

Svantaggi

Ha poca sensibilità per rilevare basse quantità di proteine. Il lavoro svolto da Fuentes e collaboratori afferma che il metodo del test Biuret ha un limite di rilevamento di 1 mg/ml di proteina e un limite di quantificazione di 3 mg/ml.

Tuttavia, un'altra ricerca condotta presso l'Università di Amazon riporta valori molto più bassi. Il limite di rilevamento che lo studio riporta è 0,020 mg/ml e il limite di quantificazione di 1.33 mg/ml.

Applicazioni

Il reagente o il test Biuret viene utilizzato per la determinazione delle proteine ​​nei campioni clinici e non clinici nei laboratori di routine e di ricerca.

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Patologie che studiano o diminuivano Proteine

In molte patologie è importante determinare la concentrazione di proteine ​​totali nei campioni clinici, essendo in grado di essere elevato o ridotto.

Sono elevati in:

-Mieloma multiplo,

-Lupus eritematoso sistemico,

-Endocardite batterica,

-Meningite batterica,

Waldestrom macroglobulinemia, tra gli altri.

È diminuito in:

-Insufficienza renale,

-Persone con grave malnutrizione,

-Pazienti con infezioni croniche, tra gli altri.

Campioni clinici

I campioni clinici più comuni sono siero, plasma e urina. Il valore normale delle proteine ​​sieriche o plasmatiche è 6.0-8.8 gr/dl.

La concentrazione di proteina negli adulti negli adulti non supera la figura di 150 mg/24 ore.

Valore normale dell'indice della proteina di urina/creatinina nelle urine

Neonati: < a 0,50 mg

Bambini di età pari o superiore a 2 anni: indice: 0,20 mg

Adulti: < 0,2 mg

Campioni non clinici

La reazione Biuret può essere utilizzata per molti tipi di campioni non clinici, come prodotti lattiero -caseari, sieri antifidi o qualsiasi sostanza sconosciuta a cui è desiderata la presenza di proteine.

Riferimenti

1. Vázquez J, Guerra L, Quintana J, Ramírez J, Fernando Ry Vázquez e. (2014). Caratterizzazione fisica-chimica e contenuto proteico degli estratti fluidi di ostrione di mangrovie (crassostrearizophore). Cuban Journal of Chemistry, 26 (1), 66-74. Estratto il 26 giugno 2019 da http: // scielo.SLD
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4.  Fuentes F, Quispe I, García J. Standardizzazione del metodo Biuret Per quantificare la proteina totale nel siero anticotropico multiuso prodotto presso il National Biological Products Center. Bol - Inst NAC Health 2012; 18 (11-12).  Disponibile su: repository.Ins.Gob.PE
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