Half Löwenstein-Jensen Foundation, preparazione e uso

Lui Middle Löwenstein-Jensen È un mezzo solido selettivo per l'isolamento e lo sviluppo di batteri del genere Mycobacterium, come Mycobacterium tuberculosis, M. Avio, Tra gli altri, ad eccezione delle specie di leprae, che non è coltivabile.

I batteri del genere Mycobacterium non crescono nei terreni di coltura convenzionali, quindi era necessario progettare un mezzo speciale per il suo isolamento. Il mezzo originale è stato creato da Löwenstein ed è stato quindi modificato da Jensen.

Mezzo löwenstein-jensen con colonie di tubercolosi Mycobacterium. Fonte: Agarwal et al / Biomed Central Ltd., Per gentile concessione della biblioteca di immagini di biologia

La modifica consisteva nell'eliminazione del colorante rosso del Congo, sostituendola per una maggiore concentrazione di verde malachite. Ha anche alterato le concentrazioni di citrato di magnesio e fosfato monopotasico.

Il mezzo di losa Löwenstein contiene attualmente un amido papaato, asparragina, citrato magnetico, fosfato monopo-fase, solfato magnetico, verde malachite, acido nalidíxico, cicloesimidia.

Mycobatteri è normalmente isolato da siti che non sono sterili, come espettorato, urina, ascessi, tra gli altri. Ciò significa che la maggior parte dei campioni conterrà il solito microbiota dell'area, oltre al patogeno.

Ecco perché il mezzo Löwenstein-Jensen contiene una serie di inibitori nella sua composizione rappresentata da Malachite Green, Antibiotici e antifungini.

Inoltre, i campioni provenienti da un sito non sterile devono essere decontaminati e neutralizzati prima di essere seminati nel mezzo di Löwenstein-Jensen.

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Base

La presenza di uova e glicerina nel mezzo di Löwenstein-Jensen stimola la crescita dei micobatteri perché forniscono acidi grassi e proteine ​​necessarie per lo sviluppo di questi microrganismi.

Il mezzo Löwenstein-jensen contiene il verde malachite, che è un inibitore del microbiota di accompagnamento. Ma contiene anche acido nalidíxica (35 µg/mL), che inibisce il microbiota gram negativo, cicloesimide (400 µg/ml), che inibisce i funghi e i lieviti di saprofiti e linciaggio (2µ/ml), che inibisce il grano microbita positivo positivo.

Alcune case commerciali preferiscono aggiungere la seguente combinazione di antibiotici: Polymixina B 200.000 unità/L, amfotericina B 10 mg/L, carbenicillina 50 mg/L e trimetoprima 10 mg/L.

Questo mezzo non contiene agar, quindi la solidificazione del mezzo si verifica dalla coagulazione dell'albumina presente nell'uovo durante la sterilizzazione.

Preparazione

Pesare 37,3 g del mezzo disidratato in 600 ml di acqua distillata che è stata precedentemente aggiunta 12 ml di glicerolo. La miscela viene riscaldata, spesso mescolando fino alla sua dissoluzione totale. Autoclavar il mezzo a 121 ° C per 15 minuti.

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D'altra parte, una sospensione omogenea di 1000 ml di uova fresche dovrebbe essere preparata in condizioni asettiche. Aggiungere la sospensione dell'uovo a 600 ml preparati a una temperatura di 50 - 60 ° C, evitando le bolle d'aria.

Le soluzioni antibiotiche vengono anche aggiunte dopo la sterilizzazione in autoclave.

Versare il mezzo in tubi di prova sterili con una spina filettatura. Scaldare i tubi a 85 ° C per 45 minuti in posizione inclinata.

Il colore del mezzo preparato è verde aguamarino e può presentare punti bianchi per la presenza di lipidi delle uova.

Il pH medio deve essere 7,2 ± 0,2

Salva i tubi del frigo e protetti dalla luce diretta fino a utilizzare. Affondare prima di seminare.

C'è una modifica del mezzo chiamato "Modifica Gruft del Löwenstein Jensen". Questo contiene gli stessi composti del terreno classico ma viene aggiunto RNA-5mg/100 ml e come inibitori contiene l'acido acido di acido Ug/ml della penicillina 50 U/Ml di Nalidíxico 35 Ug/ml di Nalidíxico 35 Ug/ml.

Applicazioni

Il mezzo Löwenstein-Jensen viene utilizzato per l'isolamento di micobatteri, da vari tipi di campioni. Si consiglia di eseguire una colorazione Ziehl-Neelsen a qualsiasi campione in cui è sospetta la presenza di micobatteri.

Alcuni campioni provengono da siti sterili ma altri no. I campioni non sterrili devono essere decontaminati in quanto il caso potrebbe essere:

Espettorato

I campioni di espettorato devono essere decontaminati come segue: determinare la quantità di campione di espettorato in ml e aggiungere alla stessa quantità di NaOH al 4% e incobe a 37 ° C.

Scuoti spesso la miscela per un periodo di 30 minuti. Successivamente centrifughe a 3000 giri / min per 30 minuti.

Scartare il surnatante su una soluzione fenolica disinfettante. Usa il sedimento di semina, ma prima il pH deve essere neutralizzato.

Per neutralizzare il sedimento, viene utilizzato h₂SW₄ al 5% in presenza dell'indicatore di fenolo rosso fino a quando non porta a un pH neutro che ha origine un colore di salmone.

Lavaggio gastrico, lavaggio bronchiale e aspirato bronchiale

In questo caso, il campione dovrebbe essere centrifuga a 3000 giri / min per 30 minuti. Il surnatante viene scartato e il sedimento viene utilizzato. Per decontaminare il sedimento, vengono aggiunti 3 ml di NaOH al 4% e spesso agitato a 37 ° C per un periodo di mezz'ora.

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Centrifuga di nuovo, il surnatante viene scartato e il sedimento viene utilizzato. Quest'ultimo deve essere neutralizzato come spiegato nel campione dell'espettorato.

Urina

Lascia che il campione in frigorifero per 24 ore. Separare il surnatante. Il sedimento rimanente deve essere centrifugato per 30 minuti a 3000 RMP. Scartare nuovamente il surnatante e ricostituire il sedimento con 3 ml di soluzione fisiologica sterile.

Aggiungi 3 ml di NaOH al 4% e procedi alla decontaminazione e alla neutralizzazione come descritto in precedenza.

Fluido ascitico, liquido pleurico, liquido cerebrospinale

In questo tipo di campione è centrifugato e il surnatante viene scartato. Fare un grammo al sedimento o osservare direttamente sul microscopio; Se i batteri non sono osservati, il passaggio della decontaminazione non è necessario e né la neutralizzazione.

In questo caso il campione può essere seminato direttamente usando il sedimento. Se ci sono batteri, procedere al decontamina e neutralizza come descritto sopra.

Biopsie

Questo tipo di campione deve essere aggiunto 5 ml di acqua distillata alla centrifuga successiva a 1500 giri / min per 10 minuti. Scartare il surnatante e centrifugare il sedimento a 3500 giri / min per 30 minuti. Usa il sedimento per seminare il terreno di coltura.

Hiophare laringeal

Il tampone deve essere introdotto in un tubo sterile contenente parti uguali di acqua distillata e 4% NaOH. Il tampone deve essere premuto sulle pareti del tubo in modo che il campione sia diluito nel liquido. Centrifuga e usa sedimenti. Neutralizzare il sedimento come già descritto.

Seminato

I media Löwenstein-Jensen sono inoculati aggiungendo 0,5 ml del campione sulla superficie del mezzo. Ruotare il tubo per distribuire il campione su tutto il mezzo. Non indossare la maniglia di platino.

È possibile seminare un secondo tubo contenente mezza pietra per isolare Mycobacterium bovis e altre specie che non crescono nell'ambiente di Löwenstein-Jensen.

Incubazione

I tubi inoculati sono incubati in aerobiosi a 37 ° C, con un coperchio leggermente pigro e inclini a circa 5 ° e protetti dalla luce. L'ambiente con anidride carbonica può essere arricchito al 5-10%. Controlla le colture due volte a settimana fino all'aspetto delle colonie.

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Quando il campione è stato assorbito, le tapas vengono regolate. Il tempo massimo di incubazione è di 8 settimane, se dopo questo tempo non vi è alcuna crescita come negativo.

QA

Come controllo di qualità puoi utilizzare i seguenti ceppi:

Mycobacterium tuberculosis ATCC 27294,  Mycobacterium kansasii ATCC 12478, Mycobacterium avium ATCC 19291, Mycobacterium bovis ATCC 19219, Mycobacterium fortuitum ATCC 6841, Escherichia coli ATCC 25922, Streptococcus pyogenes ATCC 19615, Cryptococcus neoformans ATCC 32045

Per le prime tre specie menzionate, si prevede uno sviluppo eccellente, a M. Fortuitum La crescita deve essere buona, mentre per M. Bovis è prevista una crescita scarsa o zero. Mentre le specie diverse dal genere Mycobacterium devono essere completamente inibite.

Limitazioni

Il mezzo preparato deve proteggersi dalla luce e prolungata esposizione alla luce rende il mezzo vire dal verde al blu, in questo caso il mezzo non può più essere usato. Questo perché il verde della malachite è fotosensibile.

Il mezzo, in quanto contiene l'uovo, può essere facilmente contaminato se non è manipolato asettico. Può essere sciolto se contaminato con batteri proteolitici.

La coltivazione e la manipolazione dei batteri del genere Mycobacterium richiedono personale qualificato, che è a conoscenza delle misure di biosicurezza che devono essere adeguate per evitare di essere contaminati o contaminanti gli altri.

L'HCL non deve essere usato nel passaggio della neutralizzazione a causa della formazione di cloruro di sodio, che può essere tossico per Koch Bacillus.

I campioni devono essere mantenuti in frigorifero e protetti dalla luce fintanto che non vengono elaborati.

Riferimento

1. Laboratori Francisco Soria Melguizo. 2009. Medium selettivo di Löwenstein-Jensen. Disponibile su: F-Soria.È
2. Britania Laboratories. 2017. Medium Löwenstein-Jensen. Disponibile su: Britaniab.com.
3. Neogen Laboratories. Medium Löwenstein-Jensen. Disponibile su: sicurezza alimentare.Neogen.com.
4. "Medio di Löwenstein-Jensen." Wikipedia, Enciclopedia gratuita. 20 nov 2018, 15:15 UTC. 24 aprile 2019, 18:34. Wikipedia.org
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