Funzioni, tipi ed esempi di Endonucleas

IL endonuclea Sono enzimi che tagliano i collegamenti di fosfoditester situati all'interno della catena nucleotidica. I siti di restrizione delle endonucleasi sono molto vari. Alcuni di questi enzimi tagliati al DNA (acido desossiribonucleico, il nostro materiale genetico) quasi ovunque, cioè non specifici.

Al contrario, esiste un altro gruppo di endonucleasi che sono molto specifiche nella regione o nella sequenza che si divideranno. Questo gruppo di enzimi è noto come enzimi di restrizione e sono molto utili nella biologia molecolare. In questo gruppo abbiamo gli enzimi ben noti bm hi, eco ri e alu i.

Endonucleasi tagliati internamente al DNA.
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Contrariamente alle endonucleasi, esistono altri tipi di proteine ​​catalitiche - esonucleasi - che sono responsabili della rottura del collegamento al fosfodizia alla fine della catena.

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Restrizione endonucleasi

Gli enzimi di restrizione o restrizione sono proteine ​​catalitiche responsabili della divisione dei collegamenti di fosfodiester all'interno della catena del DNA in sequenze molto specifiche.

Questi enzimi possono essere acquisiti in più società di biotecnologie e il loro uso è quasi indispensabile nelle attuali tecniche di gestione del DNA.

Le endonucleasi di restrizione sono denominate usando le prime lettere del nome scientifico binomiale dell'organismo da cui vengono, seguiti dalla tensione (questo è facoltativo) e termina con il gruppo enzimatico di restrizione a cui appartengono a cui appartengono. Ad esempio, Bam Hi ed Eco Ri sono endonuclea molto usate.

La regione del DNA che l'enzima riconosce è chiamata sito di restrizione ed è tipica di ciascuna endonucleasi, sebbene diversi enzimi possano coincidere nei siti di restrizione. Questo sito è generalmente.

Le sequenze palindromiche sono sequenze che, sebbene lette in 5 "a 3" o 3 "a 5", sono identiche. Ad esempio, nel caso di Eco Ri, la sequenza palindromica è: Gaattc e CTTAAG.

Funzioni e applicazioni di endonucletti di restrizione

Fortunatamente per i biologi molecolari, i batteri si sono sviluppati nel corso dell'evoluzione una serie di endonucleasi di restrizione che il materiale genetico frammento interno.

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In natura, questi enzimi si sono evoluti - presumibilmente - come sistema di protezione batterica contro l'invasione di molecole di DNA estranee, come quelle dei fagi.

Al fine di discriminare tra il proprio materiale genetico estero, queste endonucleasi di restrizione possono riconoscere sequenze nucleotidiche specifiche. Pertanto, il DNA che non possiede questa sequenza può essere senza disturbi all'interno dei batteri.

Al contrario, quando l'endonucleasi riconosce il sito di restrizione, si unisce al DNA e lo taglia.

I biologi sono interessati a studiare il materiale genetico degli esseri viventi. Tuttavia, il DNA è formato da diversi milioni di coppie di basi di lunghezza. Queste molecole sono estremamente lunghe e dovrebbero essere analizzate in piccoli frammenti.

Per raggiungere questo obiettivo, le endonucleasi di restrizione sono integrate nei vari protocolli di biologia molecolare. Ad esempio, un singolo gene può essere catturato e replicato per l'analisi futura. Questo processo è chiamato "Clon" una gen.

Polimorfismo della lunghezza dei frammenti di restrizione (RFLP)

I polimorfismi di lunghezza dei frammenti di restrizione si riferiscono al modello di sequenze nucleotidiche specifiche nel DNA che le endonucleasi di restrizione sono in grado di riconoscere e tagliare.

Grazie alla specificità degli enzimi, ogni organismo è caratterizzato da un modello di taglio specifico nel DNA, causando un frammento di lunghezze variabili.

Tipi di endonucleasi di restrizione

Storicamente, le endonucleasi di restrizione sono state classificate in tre tipi di enzimi, designati con numero romano. Ultimamente, è stato descritto un quarto tipo di endonucleasi.

Tipo I

La caratteristica più importante delle endonucleasi di tipo I è che sono proteine ​​formate da diverse subunità. Ognuno di questi funziona come un singolo complesso proteico e di solito ha due subunità chiamate r, due m e una s.

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La porzione S è responsabile del riconoscimento del sito di restrizione del DNA. La subunidità R, nel frattempo, è essenziale per Clivaje e M è responsabile della catalizzazione della reazione di metilazione.

Esistono quattro sottocategorie di enzimi di tipo I, noti per le lettere A, B, C e D, che sono comunemente usate. Questa classificazione si basa sulla complementazione genetica.

Gli enzimi di tipo I furono le prime endonucleasi di restrizione da scoprire e purificare. Tuttavia, i più utili in biologia molecolare sono quelli di tipo II che saranno descritti nella prossima sezione.

Tipo II

Le endonucleasi di restrizione di tipo II riconoscono specifiche sequenze di DNA e eseguono il clivaje in una posizione costante vicino a una sequenza che produce fosfati 5 'e idrossili 3'. Generalmente richiedono cofattori a ioni di magnesio (MG²⁺), Ma ci sono alcuni che hanno molti più requisiti specifici.

Strutturalmente, possono apparire come monomeri, tweet o persino tetrameri. La tecnologia ricombinante utilizza endonucleasi di tipo II e per questo motivo sono stati caratterizzati più di 3500 enzimi.

Tipo III

Questi sistemi enzimatici sono composti da due geni, chiamati Mod E manzo, Quel codice per le subunità che riconoscono il DNA e per modifiche o restrizioni. Entrambi i secondi sono necessari per la restrizione, un processo totalmente dipendente dall'idrolisi ATP.

Per essere in grado di dividere la molecola di DNA, l'enzima deve interagire con due copie della sequenza di riconoscimento non -plaindromica e i siti devono essere in un orientamento inverso nel substrato. Il cliving è preceduto da una traslocazione del DNA.

Tipo IV

Ultimamente è stato identificato un gruppo aggiuntivo. Il sistema è composto da due o più geni che codificano per le proteine ​​che hanno diviso solo sequenze di DNA modificate, sia metilata, idrossimetilata o idrometilizzata glucosil.

Ad esempio, l'enzima ECKKMCRC riconosce due dyucleotidi della forma RMC generale; Una purina seguita da una citosina metilata, che può essere separata da diverse coppie di basi - da 40 a quasi 3000. La divisione richiede circa 30 coppie di basi dopo il sito che l'enzima riconosce.

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Endonucleas Tipo V

Le endonucleasi di questo tipo sono anche conosciute come endonuclea "Homing". Questi enzimi riconoscono e tagliano la sequenza bersaglio del DNA in siti di genoma unici da 14 a 40 bp.

Matgun Questi enzimi sono codificati in introni e si ritiene che la loro funzione sia quella di promuovere il trasferimento orizzontale delle sequenze di taglio. Dopo il taglio c'è una riparazione della rottura nella doppia elica del DNA in base alla sequenza complementare.

Esempi

L'endonucleasi i di E. coli Agisce come un sistema di difesa contro fagi e parassiti. Si trova principalmente tra la membrana citoplasmatica e la parete cellulare. Produce due pause di chiusura nel DNA estraneo con cui interagisce nello spazio perplapsmico.

Le endonucleasi di tipo CRISPR-Cas sono enzimi che agiscono nel meccanismo di difesa di molti tipi di batteri. Questi identificano e tagliano specifiche sequenze di DNA di organismi invasori, che sono generalmente virus.

Recentemente, i ricercatori del Massachusetts Institute of Technology (MIT) hanno scoperto il sistema di edizione genomica CRISPR-CAS12BM con elevata precisione per la modifica delle cellule umane.

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