Cromatografia a colonna

Cos'è la cromatografia a colonna?

IL Cromatografia a colonna È una tecnica che consente la separazione dei componenti di una miscela di sostanze, al fine di ottenere la purificazione di una sostanza specifica per l'identificazione, la caratterizzazione o l'uso.

La cromatografia a colonna ha due fasi: una fase stazionaria e una fase mobile. La fase stazionaria può essere trovata in una fase solida o liquida e le sostanze da separarsi interagiscono con essa, precedentemente o contemporaneamente all'azione della fase mobile.

Il degrado dei colori indica che le sostanze eliminano in modo diverso a causa delle loro affinità variabili da parte della fase stazionaria: la sostanza bluastra, per essere più in alto, è quella subita dalla più forte ritenzione. Fonte: максим фомич, cc di 2.0, via Wikimedia Commons

La fase mobile, d'altra parte, si muove durante la cromatografia e consente la separazione dei componenti della miscela. La fase mobile può essere trovata in uno stato liquido o gassoso e interagisce con sostanze nella cromatografia di somiglianza nelle loro polarità.

La cromatografia a colonna è una tecnica versatile che ha numerose applicazioni in vari settori, nonché in medicina. Pertanto, le tecniche cromatografiche si sono costantemente evolute: tale è il caso della cromatografia liquida ad alta risoluzione ad alta risoluzione (HPLC).

HPLC consente di analizzare, in breve tempo, numerose sostanze, poiché tutte le fasi del processo sono automatizzate. Ad esempio, è molto utile nelle sinfine di analisi della qualità dei farmaci, in cui molti campioni dovrebbero essere analizzati quotidianamente.

Abbiamo anche cromatografia per esclusione delle dimensioni, che, come suggerisce il nome, si basa sulla dimensione delle molecole e non tanto sulle loro polarità. Questa tecnica viene utilizzata quando è necessaria per separare miscele di pigmenti, resine, asfalto, biomolecole, ecc., che non differiscono troppo nella loro natura chimica.

Tipi di cromatografia a colonna

Esistono diversi tipi di cromatografia che vengono eseguiti in colonna, struttura in vetro o altro materiale, di solito sotto forma di tubi dritti. Tra i tipi di cromatografia a colonna ci sono i seguenti:

• Assorbimento o colonna.
• Partizione liquida-liquido.
• Exchange ionico.
• Esclusione per dimensione.
• Gas.
• Liquido ad alta risoluzione (HPLC).
• Affinità.

Fondamenti e materiali

Cromatografia a colonna di laboratorio

Cromatografia di adsorbimento o cromatografia a colonna

Questa cromatografia ha gli stessi principi della cromatografia a strato fine, basato sull'uso di una solida fase stazionaria della natura polare (gel di allumina o sylica) e una fase mobile costituita da un solvente non polare in stato liquido.

Le sostanze polari presenti in una miscela di sostanze interagiscono con la fase stazionaria polare e sono adsorbite da questo. Inoltre, hanno poca affinità per il solvente non polare della fase mobile.

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Nel frattempo, le sostanze a bassa polarità sono facilmente separate dalla loro unione con la fase stazionaria a causa della loro polarità; che consente loro di interagire in misura maggiore con la fase mobile non polare ed essere spostati da essa.

Cromatografia di partizione liquida-liquida

Questo termine viene utilizzato per nominare un tipo di cromatografia in cui la fase stazionaria e la fase mobile sono in uno stato liquido. La fase stazionaria è un liquido polare che permea il supporto solido, solitamente silice inerte. E la fase mobile corrisponde a un liquido non polare.

Questa disposizione di fase nella cromatografia di partizione è chiamata come una fase normale, mentre se il liquido non polare permea la silice, costituendo la fase stazionaria, sarà quindi chiamato cromatografia di partizione in fase inversa.

Cromatografia a scambio ionico

In questo tipo di cromatografia la fase stazionaria viene caricata elettricamente. Quando il tuo peso è positivo, mantiene gli anioni (-); E se il carico è negativo, ai cationi (+).

Sono spesso usati come ammina di fase stazionaria, acido solfonico, diatomee, cellulosa e sephadex (ottenuti da destrano). Questi ultimi materiali vengono aggiunti un carico positivo, ad esempio dietilamineotil (DEAE) per ottenere la DEAE-Celulosio o la DEAE-Sephadex, per interagire con gli anioni.

Possono anche essere aggiunti un carico negativo dall'unione del gruppo carbossimetilico (CM), per formare CM-Celulosio o CM-Sephadex, che funzionano come scambiatori cationici.

Le interazioni elettrostatiche esistenti in questo tipo di cromatografia possono essere regolate mediante modificazioni del pH e la forza ionica del liquido che forma la fase mobile.

Un pH neutro o di base, le proteine ​​sono generalmente caricate negativamente e interagiscono con il carico positivo del DEAE-Celulosio e della DEAE-Sephadex; Ma diminuendo il pH della fase mobile, le proteine ​​possono diventare positive e interrompere l'interazione con la carica positiva della fase stazionaria.

Usando questa strategia sperimentale, puoi separare le diverse proteine ​​presenti in una miscela.

Sono anche usati nei composti inorganici di cromatografia a scambio ionico come alluminilicatos (zeoliti).

Cromatografia ad esclusione STERICA

Questo tipo di cromatografia si basa sull'esistenza di particelle che i canali presenti all'interno, che consentono la circolazione di una sostanza di dimensioni ridotte e un basso peso molecolare attraverso di essi. Nel frattempo, le sostanze più grandi non possono attraversare i canali e sono escluse da essi.

Sebbene sembri strano, le sostanze più grandi si muovono attraverso la fase mobile più facilmente di quelle di dimensioni più piccole, poiché non sono trattenute nei canali delle particelle utilizzate in cromatografia. Tra queste particelle ci sono la zeolite e il sepaadex.

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Il SOPADEX così chiamato è stato creato dalla società di Pharmacia dal polisaccaride Dextran. Esistono molti tipi di sephadex il cui uso è selezionato in base alla dimensione molecolare o al peso delle sostanze che si desidera separare.

Gas cromatografia

In questa cromatografia la fase stazionaria copre la parete delle colonne o riempie i suoi interni, mentre la fase mobile è un gas inerte: azoto o elio. Le colonne di cromatografia sono realizzate in vetro o metallo; Sebbene attualmente abbiano forme strette di capillari, le cui pareti sono ricoperte di silice.

Le colonne di cromatografia hanno una lunghezza compresa tra 1 metro e 100 metri, essendo le colonne all'interno di un forno in grado di fornire temperature superiori a 300 ° C. Le sostanze utilizzate in cromatografia devono essere volatili, poiché devono evaporare durante la cromatografia.

Le sostanze evaporano dalla superficie della fase stazionaria secondo il suo punto di ebollizione. L'evaporazione delle sostanze si verifica a seconda dell'aumento della temperatura del forno, consentendo alle sostanze di raggiungere il loro punto di ebollizione in sequenza.

Una volta raggiunto il suo punto di ebollizione, le sostanze evaporano e vengono trascinate dalla corrente del gas inerte nel sistema di rilevamento e analisi.

La tecnica della gascromatografia è sostanzialmente analitica e non preparativa. Cioè, di solito non è usato per ottenere una certa sostanza.

Cromatografia ad alta risoluzione (HPLC)

Le basi HPLC sono simili a quelle chiamate cromatografia a colonna o adsorbimento, ma la differenza è che il solvente (fase mobile) passa attraverso la fase stazionaria, guidata da una pressione di circa 400 atmosfere.

Le colonne HPLC hanno una lunghezza compresa tra 15 e 25 cm e un diametro interno di 0.46 cm. Di solito sono realizzati in acciaio inossidabile. La fase stazionaria è formata da particelle di silice molto piccole che hanno una caratteristica polare.

Fase normale

Nella normale fase HPLC, un solvente non polare viene solitamente usato come fase mobile, di solito esano. Le sostanze polari interagiscono con la silice e emergono in modo concentrato dalle colonne cromatografiche. Nel frattempo, le sostanze non polari hanno una maggiore affinità per i solventi non polari, non interagiscono con le particelle di silice e quindi emergono rapidamente dalle colonne.

Fase inversa

Nella fase inversa così chiamata, le particelle di silice polare vengono trasformate in non polari dall'aggiunta di una catena di idrocarburi da 8 a 18 carboni. Nella fase mobile, viene utilizzato un solvente polare formato da una miscela di metanolo e acqua.

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Le sostanze polari non interagiscono con particelle di silice modificate (non polari) ma interagiscono con il solvente polare, permettendo loro di lasciare rapidamente la colonna di cromatografia, portata a un sistema di rilevamento con la presenza di luce ultravioletta.

Cromatografia di affinità

Questa cromatografia si basa sull'interazione di una particolare sostanza con un ligando per esso, fissata a un supporto che può essere agaro, desxtrano, cellulosa, ecc. La cromatografia di affinità è una tecnica utilizzata per la separazione e la purificazione delle molecole con una funzione biologica.

La tecnica di cromatografia di affinità consente la purificazione di una proteina, usando un anticorpo specifico fisso a un supporto, che costituisce la fase stazionaria. Rame, cobalto e nichel sono usati come ligando per ottenere proteine ​​che contengono l'amminoacido dell'istidina.

Viene anche utilizzata questa tecnica per la purificazione del DNA e dell'RNA, usando un acido nucleico con una sequenza di base complementare. La sostanza attaccata al suo ligando può essere separata modificando il pH o la forza ionica della soluzione utilizzata come fase mobile.

Applicazioni

La cromatografia a colonna è una tecnica utilizzata per la separazione di una sostanza da una loro miscela, per scopi o obiettivi diversi. Ad esempio: la diagnosi di un problema, l'identificazione del farmaco, l'ottenimento di una sostanza, ecc.

La cromatografia di adsorbimento viene utilizzata nell'eliminazione delle impurità di sostanze, nell'isolamento dei metaboliti dei fluidi biologici, nella determinazione degli alimenti degli acidi organici dannosi, ecc.

La cromatografia liquida ad alta risoluzione è una tecnica che ha numerosi usi, tra cui: nella rilevazione di antibiotici, sedativi, steroidi o altri interessi farmacologici; Nell'identificazione di agenti inquinanti come pesticidi, erbicidi, fenoli, ecc.

La gascromatografia è usata nello studio di molte sostanze volatili. È usato nell'industria farmaceutica nell'analisi dei farmaci, come aspirina, ibuprofene e paracetamolo. Oltre all'identificazione nelle urine degli agenti del doping, come anfetamine, cocaina, LSD, cannabis, ecc.

La cromatografia di esclusione delle dimensioni e la cromatografia di affinità sono utilizzate principalmente nell'isolamento e nella purificazione delle macromolecole biologiche, come proteine ​​e acidi nucleici.

E infine, la cromatografia a scambio ionico viene utilizzata nella purificazione di proteine ​​e polipeptidi.

Riferimenti

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