Brodo malonato, preparazione e usi

Lui Brodo di malonato È il terreno di coltura liquida utilizzato per il test diagnostico (test malonato), usato per differenziare alcuni generi della famiglia Enterobacteriace. È stato creato da Leifson in 1.933 e successivamente modificato da Ewing, che ha aggiunto una piccola quantità di estratto di destrosio e lievito nella formula originale.

Il mezzo è attualmente composto da estratto di lievito, solfato di ammonio, fosfato di dipotassio, fosfato monopotonico, cloruro di sodio, sodio malonato, destrosio e blu bromotimico. Questo test è generalmente incluso nella batteria di identificazione biochimica per gli enterobatteri, contribuendo a differenziare determinati generi e specie.

Rappresentazione grafica del test malonato. A. Test negativo, b. (Acidificazione) Test negativo, C. (Alcalinizzazione media) Test positivo. Fonte: tubi colorati di dominio pubblico.netto

Il test malonato si basa principalmente sulla capacità di alcuni microrganismi di utilizzare il sodio malonato come singola fonte di carbonio e come fonte di azoto al solfato di ammonio.

Il test malonato di solito dà positivo in alcune specie di generi Enterobacter, Klebsiella e Citrobacter. Mentre la maggior parte delle specie dei generi Escherichia, Salmonella, Shigella, Edwardsiella, Yersinia, Serratia, Morganella, Proteus e Providencia, danno una reazione negativa.

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Base

Il test malonato consiste in evidenza.

La maggior parte degli enterobatteri che non usano il malonato sono in grado di crescere in questo mezzo, prendendo come nutrienti l'estratto di destrosio e lievito.

In questo caso, qualsiasi tentativo di alcalizzazione a causa dell'uso di peptone sarà contrastato dalla produzione di acidi generati dalla fermentazione del destrosio. Allo stesso modo, i fosfati di dipotassio e monopotasici fungono da tampone mantenendo il pH a 6,7.

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Ecco perché, quando il test è negativo, il brodo è lo stesso colore originale (verde). Raramente il mezzo potrebbe essere acidificato a causa della fermentazione del destrosio; Senza l'uso di Peptonas e l'indicatore di pH trasformerebbe il colore dal mezzo a giallo. Per questo, il pH deve scendere a 6.

Ora, quando questo test è positivo che il microrganismo abbia usato rispettivamente il malonato e il solfato di ammonio come fonti di carbonio e azoto, senza usare gli altri componenti.

In questo caso il mezzo è alcalizzato a causa della liberazione del sodio e della conseguente formazione di NaOH. In questo senso, l'indicatore di pH (blu bromotimico) trasforma il colore del mezzo del verde in blu quando il pH è uguale o maggiore di 7,6. Il blu può essere chiaro o intenso (blu della Prussia).

Infine, il cloruro di sodio mantiene l'osmolarità del mezzo e l'acqua è la diligenza di tutti i componenti.

Interpretazione

Brodo dello stesso colore (verde): test negativo

Brodo giallo: test negativo

Brodo blu chiaro o intenso: test positivo

C'è una variante chiamata brodo di fenilalanina malonato, chiamata anche Shaw e Clarke Medium. In questo caso, possono essere analizzati due test, l'uso di malonato come fonte di carbonio e la produzione di acido piruvico dalla fenilalanina.

Preparazione

Brodo di malonato

La quantità di grammi specificati dall'inserto della casa commerciale prescelta sta pesando (può variare dall'una all'altra). I grammi pesanti sono sospesi in un litro di acqua distillata. Riscaldare leggermente fino alla sua completa dissoluzione. Distribuire 3 ml del mezzo in tubi di prova 13/100 con coperchio di cotone.

Sterilizzare in autoclave a 121 ° C per 15 o 20 minuti.

Freddo. Se non verranno utilizzati immediatamente, salva in frigorifero fino all'uso. Tempera i brodi a temperatura ambiente prima di inocularli.

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Il pH medio deve essere 6,7 ± 0,2. Il colore del mezzo preparato è verde bottiglia.

Brodo di fenilalanina malonato

Pesare 11 gr del mezzo disidratato e dissolversi in 1 litro di acqua distillata. Il resto della preparazione pari a quello sopra descritto.

Può anche essere preparato aggiungendo 2 gr/L di fenilalanina al mezzo di brodo malonato prima che sia sterilizzato.

Utilizzo

È usato come parte della batteria di prova biochimica che sono montate per l'identificazione dei batteri della famiglia Enterobacteriaceae.

Aiuta a distinguere tra:

-Il genere Klebsiella ed Enterobacter (+) del genere Escherichia e Serratia (-).

-La specie di Ssp arizonae entro salsonella ssp, Ssp ssp salame salmonella Salmonella enterica ssp diarizonae (+), della specie Salmonella enterica ssp enterica (-).

-Del genere Klebsiella generalmente (+) del genere Actinobacillus (-).

-A volte può aiutare la differenziazione di generi e specie di batteri non appartenenti alla famiglia Enterobacteriaceae, come tra i bacili grammi negativi non fermentanti Alcaligenes faecalis (+) Acinetobacter sp (-).

Fonte: Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnosi microbiologica. 5 ° ed. Pan -American Editoriale S.A. Argentina.

Procedura

Sotto una più leggera, viene presa una parte di una colonia pura, usando una maniglia di platino correttamente sterilizzata e raffreddata. Il campione prelevato (inoculo leggero) si dissolve nel brodo di malonato. È incubato con il coperchio pigro in aerobiosi a 35 ° C ± 0,2 per 24-48 ore.

Puoi anche inoculare il brodo di malonato da un raccolto di 18-24 ore in brodo di soia a Triptyse. In questo caso, 0,01 ml viene preso con una pipetta sterile e il brodo di malonato viene inoculato. È incubato con il coperchio pigro in aerobiosi a 35 ° C ± 0,2 per 24-48 ore.

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Finito il tempo in cui i risultati vengono interpretati. Qualsiasi vestigio di colore blu completato 48 ore di incubazione dovrebbe essere considerato positivo. Il test non deve essere interpretato come negativo fino a quando il tempo di incubazione di 48 ore non è stato adempiuto.

Nel caso dell'uso della variante del brodo di fenilalanina malonato, il malonato viene prima interpretato e quindi vengono aggiunte 5 gocce di HCl 1n e 3-5 gocce di cloruro ferrico all'8%. Un colore verde scuro viene interpretato come un test positivo per la fenilalanina. Se al contrario il mezzo diventa blu pallido, il test è negativo per la fenilalanina.

QA

Per eseguire il controllo della sterilità del mezzo, uno o due brodi devono essere incubati a 35 ° C ± 0,2 per 24 ore di incubazione. Dopo questo tempo non dovrebbero esserci torbidità o cambiamento di colore.

Per il controllo di qualità è possibile utilizzare ceppi noti o certificati, come ad esempio: Enterobacter Aerogenes ATCC 13048, Klebsiella pneumoniae ATCC 33945, Ssp arizonae entro salsonella ssp ATCC 13314 e Escherichia coli ATCC 25922.

I risultati previsti sono:

• Enterobacter Aerogenes, Klebsiella pneumoniae E Ssp arizonae entro salsonella ssp Danno una reazione positiva (mezzo blu).
• Per Escherichia coli Il risultato deve dare negativo, ovvero, si prevede che non vi sia alcun cambiamento di colore (verde) o che diventerà giallo a causa della fermentazione del glucosio.

Limitazioni

Non usare il brodo che mostra torbidità, precipitati, cambio di colore o alcun segno di deterioramento.

Riferimenti

1. Pedraza J, Sanandres N, Varela Z, Aguirre E, Camacho J. Isolamento microbiologico di Salmonella spp. e strumenti molecolari per il rilevamento. SALUTE DI MAGGIORNO. Barranquilla (col.) 2014; 30 (1): 73-94. Disponibile su: scielo.org.co
2. Bbl. Brodo malonato, ewing modificato. 2007. Disponibile su: BD.com
3. Senna Laboratories. Brodo di malonato. Disponibile su: scientifico.com
4. Renylab. Brodo di malonato. 2013. Disponibile su: questo.Renylab.ind.Br
5. Diagnostica Mbiology. Brodo di malonato. Disponibile su: mbiology.com
6. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnosi microbiologica. 5 ° ed. Pan -American Editoriale S.A. Argentina.
7. Conda Ponadisa Laboratories. Brodo di fenilalanina malonato. Disponibile su: Condalab.com