Müeller Hinton Agar What Is, Foundation, Preparation, Usi

Lui Müeller Hinton Agar È un mezzo nutrizionale solido e non selettivo, composto da infusione di carne, acido peptone di caseina, amido, presa e acqua distillata. Questo mezzo consente un eccellente sviluppo microbico dei batteri a crescita più rapida.

È stato originariamente creato da John Howard Müeller e Jane Hinton per isolare i batteri esigenti dal punto di vista nutrizionale, come Neisseria gonorrhoeae E Neisseria Meningitidis. Tuttavia, a causa delle sue caratteristiche si è rivelato ideale per lo studio della suscettibilità agli antibiotici, fornendo risultati affidabili e riproducibili.

Pertanto, il Müeller Hinton Agar è il terreno di coltura accettato dal Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) e il comitato europeo per i test di suscettibilità antimicrobica, per l'esecuzione del test di suscettibilità antimicrobica da parte del metodo di diffusione di Kirby e del bauer.

Base

Perché è un mezzo nutrizionale non selettivo, è eccellente per la crescita della maggior parte dei batteri patogeni.

D'altra parte, la sua semplice composizione fa sì che le sostanze si diffondano facilmente su di essa, essendo una caratteristica essenziale per il test di suscettibilità con il metodo di diffusione del disco.

Un'altra delle sue caratteristiche è che contiene un basso numero di inibitori, che consente di valutare efficacemente la sulfonamide, il trimetoprim e le tetracicline.

Tuttavia, si dovrebbe tenere presente che il mezzo deve soddisfare determinate condizioni per garantirne il corretto funzionamento, incluso:

L'adattamento del pH, la profondità dell'agar e la corretta concentrazione di Timina, Timidina, CA⁺⁺, Mg⁺⁺ e Zn⁺⁺.

Devi anche sapere che la metodologia è standardizzata e quindi tutti i parametri, come:

La concentrazione dell'inoculo, la concentrazione e la conservazione dei dischi antibiotici, il posizionamento del corretto numero di dischi sull'agar, la distanza tra un disco e l'altro, il posizionamento strategico di alcuni antibiotici, l'atmosfera, la temperatura e il tempo di incubazione.

Preparazione

Pesare 37 gr del mezzo Müeller Hinton disidratato e dissolversi in 1 litro di acqua distillata. Scalda l'ambiente mescolando per aiutare la tua dissoluzione. Fai bollire per 1 minuto.

Portare all'autoclave per sterilizzare a 121 ° C per 15 minuti. Quando si rimuove dall'autoclave, il fissola deve essere posizionato in un bagno da María a 50 ° C per raffreddare. Versare da 25 a 30 ml in piastre sterili di 10 cm di diametro.

Le piastre dovrebbero essere lasciate con uno spessore medio di 4 mm (ideale), consentito un intervallo di 3-5 mm.

Se si desidera preparare il sangue usando Müeller Hinton, il sangue di agnello sterile al 5% viene versato come base.

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Il pH finale del mezzo deve essere compreso tra 7,2 e 7,4.

Investire e risparmiare in frigorifero, fino all'uso. Lascia che la piastra prenda la temperatura ambiente prima di usare.

Il colore del mezzo preparato è il beige leggero.

Applicazioni

Viene utilizzato per eseguire l'antibiogramma o il test di suscettibilità agli antibiotici a patogeni di crescita più rapidi.

Se l'agar è integrato con il sangue serve a eseguire l'antibiogramma di microrganismi esigenti come: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus SP, Neisseria meningitidis, tra gli altri. È stato anche usato per isolare Legionel pneumophila.

Tecnica di antibiogramma

Prima di eseguire l'antibiogramma, deve essere preparata una soluzione batterica equivalente a 1,5 x 10⁸ Cellule.

Per fare ciò, da 3 a 4 colonie di colture pura vengono prese e sospese in un brodo di soia trittico o nel brodo di Müeller Hinton, incuba per 2-6 ore e la concentrazione con una soluzione salina sterile viene regolata, confrontandolo con un pattern Mac Farland dello 0,5%.

Se chiedono microrganismi, le colonie possono essere sospese direttamente fino alla concentrazione di Mac Farland allo 0,5%. Successivamente, la piastra di Müeller Hinton viene seminata con un tampone impregnato con la soluzione batterica preparata.

Per fare questo, il tampone è immerso nella soluzione e quindi il fluido in eccesso viene rimosso dalla pressione contro le pareti del tubo. Immediatamente dopo che il tampone passa attraverso l'intera superficie, senza andarsene senza toccare, la piastra viene leggermente girata e semina di nuovo. L'operazione viene ripetuta 2 volte di più.

Lasciare riposare per 10 minuti e poi posizionare i dischi antibiotici con un morsetto sterile, lasciando uno spazio di 24 mm tra l'uno e l'altro. Dopo aver posizionato ogni album sull'agar, premere ognuno con il morsetto per assicurarti che siano ben collegati.

Dopo il processo, la piastra viene investita e 35-37 ° C viene incubata in aerobiosi per 16-18 ore. Se si tratta di un microrganismo impegnativo, può meritare microaerofilia e se l'antibiogramma contiene dischi di oxacillina, dovrebbe essere letto a 24 ore.

Per misurare il diametro di ogni alone viene utilizzata una regola. I risultati devono essere registrati in mm. Successivamente, i valori ottenuti con le tabelle dei punti di taglio pubblicati dal manuale CLSI corrente sono correlati.

Segnala come sensibile (S), intermedio (i) o resistente (R), a seconda dei casi.

Gli antibiotici sono selezionati in base al microrganismo isolato e al tipo di infezione che sta producendo.

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A volte il posizionamento strategico degli antibiotici deve essere tenuto presente per mostrare modelli di resistenza fenotipica.

Posizionamento strategico di dischi su Müeller Hinton Agar

Per gli enterobatteri, il disco di acido clavulanico deve essere posizionato di fronte alle cefalosporine di terza e 4a generazione. Un allargamento a forma di uovo indica che la deformazione è un produttore di beta -lattamasi a spettro esteso (BLEE). Ciò significa che il paziente non deve essere trattato con cefalosporina.

In Staphylococcus è importante.

Un alone resistente all'eritromicina e una planarità nell'alone della clindamicina indica che la deformazione ha una resistenza inducibile alla clindamicina, ceppo (RIC). Ciò significa che un trattamento con clindamicina non sarà efficace.

Per la ricerca di ceppi di AMP C inducibili negli enterobatteri e alcuni bacilli gram negativi, ceftazidima, cefoxitina o piperacilina.

Un alone dorato su uno dei dischi rivolti a imipenem indica la presenza di un amplificatore inducibile C.

Per la ricerca di amp C costitutivo, una fogna da 500 µg con disco di cloxacillina. Una larghezza di guarigione in una delle cefalosporine indica la positività.

È inoltre possibile sostituire il disco di cloxacillina con un 9 mm della carta del filtro Whatman n. 6 impregnato di acido borico (400 µg) con una distanza di 18 mM. È interpretato uguale al precedente.

Infine, per studiare la produzione di metalbetalattamasi soprattutto in Pseudomonas aeruginosa, Viene utilizzato un disco impregnato con 10 µl di acido etilendiamercacetico (EDTA 750 µg) e acido tioglimicolico (SMA 300 µg), che affronta i dischi Imipenem e Meropenem, a una distanza di 15 mM.

Il test è positivo se c'è un ampliamento di alos Imipenem o Meropenem verso l'album EDTA/SMA. Questo risultato deve essere confermato dal test Hodge modificato.

Questo metodo consiste nell'inoculare una tensione di Escherichia coli ATCC 25922 sulla piastra Müeller Hinton. Viene posizionato un disco imipenem al centro della piastra e quindi viene realizzato uno stro del disco alla periferia con la tensione P. Aeruginosa sospettoso. Puoi provare fino a 4 ceppi per piastra.

Il test sarà positivo se esiste una zona di distorsione dell'alone Imipenem attorno allo Stro.

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Cause di risultati errati

-I dischi antibiotici gravemente conservati possono produrre falsa resistenza. Ad esempio, il disco di oxacillina è molto vulnerabile alle variazioni di temperatura.

-Un pH del mezzo al di sotto dell'acido (acido) produce aloni più piccoli negli aminoglicosidi e macrolidi (rischio di falsa resistenza) e aloni più grandi in penicillina, tetraciclina e novobiocina (rischio di falsa sensibilità).

-Se il pH è al di sopra dell'indicazione (alcalina) gli effetti sopra descritti sono investiti.

-I media con elevate concentrazioni di timina e timidina influenzano significativamente la riduzione della sulfonamide e l'inibizione del trimtoprim Hals.

-Alte concentrazioni di calcio e magnesio producono falsa resistenza di aminoglicosidi, polimixina B e tetracicline davanti ai ceppi di Pseudomonas aeruginosa.

-Basse concentrazioni di calcio e magnesio producono false sensibilità di aminoglicosidi, polixina B e tetracicline davanti ai ceppi di Pseudomonas aeruginosa.

-La presenza di zinco influisce sui risultati dei dischi carbapenem (Imipenem, Meropenem ed Ertapenem).

-Lo spessore del mezzo inferiore a 3 mm produce risultati di falsa sensibilità, mentre uno spessore superiore a 5 producerà una falsa resistenza.

-La mobilitazione dei dischi nell'antibiogramma fornirà aloni deformati, poiché lo scarico di antibiotici è immediato.

- Gli inoculari molto deboli influiscono sui risultati, poiché non vi sarà alcuna crescita uniforme o convergente nell'agar, una condizione necessaria per misurare i aloni di inibizione, oltre agli aloni può dare più grande del normale.

-Gli inoculos troppo caricati possono dare Hals più piccoli del normale.

-Non rispettare la distanza tra i dischi fa una sovrapposizione di alone con un'altra e non può essere letta correttamente.

-Incubare con co₂ Aumenta gli aloni della tetraciclina e dei dischi di meticillina.

-Incubare a temperature inferiori a 35 ° C produce aloni più grandi.

-L'aggregato del sangue riduce le dimensioni dell'alone del sulfamide.

Limitazione

La sensibilità di un antibiotico dimostrato nell'antibiogramma contro un microrganismo (In vitro) Non è una garanzia che funzionerà In vivo.

QA

Per sapere se il mezzo contiene la giusta quantità di timina, è necessario seminare una tensione di Enterococcus faecalis ATCC 29212 e dimostrare la suscettibilità al solfametoxazolo (SXT), deve dare un alone uguale o> 20 mm per essere soddisfacente.

Riferimenti

1. Cona e. Condizioni per un buon studio di suscettibilità mediante test di diffusione. Rev Chil Infect, 2002; 19 (2): 77-81
2. Britania Laboratories. Müeller Hinton Agar. Disponibile su: Britaniab.com