Agar Count Standard Fondazione, preparazione e usi

Lui standard di agar È un terreno di coltura solido e non selettivo, progettato per la quantificazione del carico microbico aerobico presente nelle acque di consumo, nelle acque reflue, nelle bevande lattiero -casearie, tra gli altri alimenti. Questo mezzo è anche noto come agar PCA) per il suo acronimo nell'agar di conteggio delle piastre inglesi. Fu creato nel 1953 da Buchbinder, Baris e Goldstein.

Il mezzo di account standard è composto da estratto di lievito, tripteina, glucosio, agar e acqua distillata. Questa formulazione contiene elementi di base nutrizionali che consentono lo sviluppo del carico microbico aerobico attuale e non richiesto.

Diluizioni decimali per il conteggio di conteggio UFC. Fonte: Quentin Geissmann [CC BY-SA 3.0 (https: // creativeCommons.Org/licenze/by-sa/3.0)]

Poiché il mezzo non contiene inibitori, i batteri possono svilupparsi senza alcuna restrizione, quindi è l'ideale per il conteggio delle colonie generali. Tuttavia, la tecnica di quantificazione della placca non rileverà tutti i batteri presenti, ma solo quelli che sono in grado di crescere in condizioni ambientali a cui è sottoposto l'agar.

In questo senso, la tecnica di quantificazione della placca è generalmente determinata dalla quantità di batteri di tipo mesofilo aerobico, cioè quelli che sono sviluppati a temperature tra 25 e 40 ° C, con una temperatura di crescita ottimale a 37 ° C.

Questo gruppo batterico è molto importante, perché ci sono più batteri patogeni per l'uomo.

Va notato che a volte gli interessi quantificano la quantità di batteri psicrofili presenti nel cibo. Questi batteri sono quelli che si sviluppano a basse temperature (< 20°C) y son las responsables de que los alimentos se descompongan más rápido, aun estando en nevera.

Allo stesso modo, i batteri termofili, che si sviluppano in un intervallo tra 50 ° C a 80 ° C o più, possono essere importanti in alcuni tipi di alimenti come in scatola.

La quantificazione microbica è espressa in unità di formazione del colon (UFC) per grammo o millilitro campione.

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Base

L'account standard è progettato per consentire lo sviluppo soddisfacente di batteri aerobici non comportamentali, poiché l'estratto di lievito, la tripteina e il glucosio forniscono i nutrienti necessari per un buon sviluppo microbico.

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D'altra parte, il mezzo ha un colore chiaro e un aspetto trasparente, quindi è ideale per la visualizzazione delle colonie sviluppate dal metodo in -profonde (fuoriuscita di piastre).

È anche possibile che le colonie contano con il metodo piantato di superficie con drigalski spatola.

Quando il carico microbico è elevato, le diluizioni decimali del campione in studio devono essere fatte per essere in grado di eseguire il conteggio UFC.

Va notato che questo mezzo è raccomandato dall'American Public Health Association (APHA) per i conteggi aerobici di Messofili.

Preparazione

Pesare 23,5 gr del mezzo disidratato e dissolversi in un litro di acqua distillata. Per sciogliere completamente la miscela dovrebbe essere riscaldata agitando frequentemente fino a bolle. I seguenti passaggi dipendono dalla tecnica piantata che verrà utilizzata.

Per la tecnica di scarico della piastra

Distribuire dando da 12 a 15 ml nei tubi di prova. Successivamente, sterilizzare in autoclave a 121 ° C per 15 minuti. Lascia che si solidifichi verticalmente sotto forma di un taco. Salva fino all'uso.

Sciogli il taco quando verrà utilizzato. Una volta che puoi tenerlo in Maria a 44-47 ° C mentre i campioni sono preparati.

Per superficie seminata

Sterilizzare il mezzo in autoclave a 121 ° C e quindi distribuire 20 ml in piastre sterili di Petri. Lascia che solidificare, investire e risparmiare in frigorifero fino all'uso.

Tempestare le piastre prima di usare. Il pH medio deve essere 7,0 ± 0,2.

Utilizzo

Il racconto standard viene utilizzato nella tecnica di conteggio mesofilo aerobico durante l'analisi microbiologica di acqua e cibo. È necessario il resoconto del mesofilo aerobico, poiché determina la qualità della salute del campione in studio.

L'applicazione di questa tecnica (usando questo mezzo) consente la visualizzazione macroscopica di colonie isolate per la quantificazione.

Tecnica di scarico della piastra (seminata con profondità)

-Procedura

La tecnica consiste nei seguenti:

1) Omogeneizzare il campione per ridistribuire i batteri presenti.

2) Una sospensione iniziale viene eseguita in una bottiglia o una borsa sterile, rispettando il rapporto 10 GR o 10 ml in 90 ml di diluente (10^-1).

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3) Dalla sospensione iniziale, le diluizioni decimali rilevanti vengono effettuate a seconda del tipo di campione. Es: (10^-2, 10^-3, 10^-4). Le diluizioni vengono eseguite con la soluzione di tampone acqua o fosfato di Peptonada.

Per questo^-2 e così via.

4) 1 ml di ogni diluizione viene preso e posizionato su piastre di petrie sterili vuote.

5) Aggiungi a ciascuna piastra da 12 a 15 ml di agar precedentemente fuso e riposato a 44 - 47 ° C.

6) Dare movimenti rotanti morbidi alle piastre per distribuire il campione accanto all'agar uniformemente e lasciare solidificare.

7) Investire le piastre e incubare a 37 ° C in aerobiosi per 24-48 ore.

8) Culminato il tempo procede ad esaminare le piastre e contare le colonie nella diluizione che le consente. Quelle piastre che hanno tra 30 e 300 UFC sono scelte per l'account.

Il conteggio può essere fatto manuale o può utilizzare la squadra di contabili contabili della colonia.

I valori consentiti da ml di campione possono variare da un paese all'altro secondo le regole con cui sono governati.

-Calcolo UFC

Il calcolo generale viene eseguito utilizzando la seguente formula:

Formula per il calcolo generale della quantificazione UFC. Fonte: National Drug Administration and Medical Technology (ANMAT). Analisi microbiologica del cibo, metodologia analitica ufficiale, microrganismi indicatore. Volume 3 2014. Disponibile su: Anmat.Gov.ar

Esprimi i risultati in 1 o 2 cifre, moltiplicando per la base appropriata 10. Esempio: se il risultato è 16.545 è arrotondato in base alla terza cifra a 17.000 e sarà espresso come segue: 1,7 x 10⁴. Ora, se il risultato era 16.436 è arrotondato a 16.000 ed esprime 1.6 x 10⁴.

Tecnica seminata in superficie

-Procedura

-Inoculare con 0,1 ml del campione diretto se è liquido, sospensione iniziale 10^-1 o di diluizioni consecutive 10^-2, 10^-3 ecc., al centro di una targa standard.

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-Distribuire il campione con drigalski spatola o asta di vetro sotto forma di L. Lasciare riposare per 10 minuti.

-Investire le piastre e incubare in aerobiosi a 37 ° C per 24-48 ore.

-Procedi a contare le colonie, scegli quelle piastre che si trovano tra 20 e 250 UFC.

-Calcolo UFC

Per il calcolo viene applicato il fattore di diluizione, che è l'inverso. Il numero per 2 cifre significative è arrotondato (arrotondamento secondo la terza cifra) ed è espresso nella potenza di base 10. Ad esempio, se 224 UFC vengono contati nel campione senza diluizione (10^-1), È riportato 22 x 10¹  UFC, ma se la figura era 225 viene segnalata 23 x 10¹ Ufc.

Ora, se 199 UFC vengono contati in diluizione 10^-3, Verrà segnalato 20 x 10⁴ UFC, ma se 153 UFC vengono conteggiati nella stessa diluizione verranno segnalati 15 x 10⁴ Ufc.

QA

Il mezzo di account standard può essere valutato utilizzando ceppi noti certificati, come ad esempio: Escherichia coli ATCC 8739, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus subtilis ATCC 6633, Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Shigella flexneri ATCC 12022.

Se il terreno di coltura è in condizioni ottimali, è prevista una crescita soddisfacente in tutti i casi, ad eccezione di L. Fermentum che può avere prestazioni regolari.

Per valutare la sterilità del terreno di coltura, una o due piastre di ciascun lotto preparato (senza inocularsi) a 37 ° C in aerobiosi per 24 ore devono essere incubate. Dopo questo tempo, non è necessario osservare alcuna crescita o cambiamento di colore del mezzo.

Limitazioni

-Non sciogliere l'agar più di una volta.

-Il mezzo preparato può durare fino a 3 mesi finché rimane in frigo e protetto dalla luce.

-Questo mezzo non è adatto a microrganismi o anaerobi esigenti.

Riferimenti

1. National Administration of Medicines Food and Medical Technology (ANMAT). Analisi microbiologica del cibo, metodologia analitica ufficiale, microrganismi indicatore. Volume 3 2014. Disponibile su: Anmat.Gov.ar
2. Diffco Laboratories Francisco Soria Melguizo, s.A. Agar per conteggio delle piastre. 2009. Disponibile su: http: // f-soria.È
3. Conda Ponadisa Laboratories. Agar per metodi standard (PCA) secondo APHA e ISO 4833. Disponibile su: Condalab.com
4. Britania Laboratories. Conteggio delle piastre di agar. 2015. Disponibile su: Britaniab.com
5. Camacho A, Giles M, Ortegon A, Palao M, Serrano B e Velázquez o. 2009. Tecniche per l'analisi microbiologica alimentare. 2nd ed. Facoltà di chimica, Unam. Messico. Disponibile su: Depa.Fquim.UNAM