Simmons Citrate Agar

Pseudomonas fluorescens in Simmons Citrato Agar. Fonte: un dubbio, CC BY-SA 3.0, Wikimedia Commons

Cos'è Simmons Citrato APAR?

Lui Simmons Citrate Agar È un mezzo solido usato come test biochimico di identificazione dei microrganismi, in particolare bacilli Gram -negativi. Il mezzo originale è stato creato da Koser nel 1923.

Il mezzo citrato di Koser consisteva in un brodo contenente fosfato di sodio, fosfato di ammonio, fosfato monopotonico, solfato di magnesio e citrato di sodio.

Come si può vedere, l'unica fonte di carbonio nel mezzo è il citrato e l'azoto è il fosfato di ammonio, omettendo proteine ​​e carboidrati come fonte di questi elementi, comunemente presenti in altri media.

Pertanto, i batteri inoculati in quel mezzo possono riprodursi solo se è in grado di prendere il carbonio del citrato. Il test è stato positivo se c'erano torbidità nel mezzo. Tuttavia, ho avuto l'inconveniente che potesse verificarsi torbidità non specifica.

Questo problema è stato risolto da Simmons aggiungendo Bromotimol Agar alla formula originale di Koser. Sebbene il principio sia lo stesso, viene interpretato in modo diverso.

Base

Alcuni batteri hanno la capacità di sopravvivere in assenza di fermentazione o produzione di acido lattico, che hanno bisogno di ottenere energia attraverso l'uso di altri substrati. In questo test l'unica fonte di carbonio offerta è citrato.

I batteri in grado di sopravvivere in queste condizioni metabolizzano rapidamente il citrato con un percorso alternativo a quello tradizionale, usando il ciclo dell'acido tricarbossilico o il ciclo di fermentazione del citrato.

Il catabolismo del citrato da parte dei batteri comprende un meccanismo enzimatico senza l'intervento del coenzima a. Questo enzima è noto con il nome di Citrica (citrato ossalacetato-liasa) o demolasi citrato. La reazione richiede la presenza di un catione bivalente, che in quel caso viene fornito dal magnesio.

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La reazione genera ossaloacetato e piruvato, che quindi danno origine ad acidi organici nel mezzo di un pH alcalino formato dall'uso della sorgente di azoto. Questi acidi organici sono usati come fonte di carbonio che generano carbonati e bicarbonati, alcalizzando ulteriormente il mezzo.

Modalità seminata

Il mezzo di citrato di Simmons deve essere leggermente inoculato nella coda di pesce usando dritto o ago e incubato per 24 ore a 35-37 ° C. Culminato il tempo che i risultati si osservano.

Il seminato viene fatto solo sulla superficie dell'agar, senza foratura.

Interpretazione

Se il mezzo è il colore originale (verde) e non vi è alcuna crescita visibile, il test è negativo, ma se il mezzo cambia blu, indica la presenza di prodotti alcalini, che viene rilevato dall'indicatore di pH. In questo caso, il test è positivo.

Ciò accade perché se i batteri usano il carbonio del citrato, è anche in grado di prendere l'azoto dal fosfato di ammonio con cui rilascia l'ammoniaca, alcalizzando il mezzo.

D'altra parte, se la crescita dei batteri è osservata nel mezzo, ma non vi è alcun cambiamento di colore, il test deve essere considerato positivo, poiché se c'è crescita, significa che i batteri sono stati in grado di usare il citrato come un fonte di carbonio, sebbene al momento non vi è alcun cambiamento di pH (a volte può richiedere).

In caso di dubbi nell'interpretazione del colore finale, può essere confrontato con un tubo di citrato non raccolto.

Preparazione

Pesare 24,2 gr del mezzo disidratato per un litro d'acqua. Mescolare e lasciare a circa 5 minuti. Termina la dissoluzione del riscaldamento medio per 1 o due minuti, agitando frequentemente.

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Servire 4 ml in prove e tubi autoclavar a 121 ° C per 15 minuti. Quando si lascia l'autoclave, inclinarsi con l'aiuto di un supporto, in modo che l'agar sia solidificato sotto forma di un picco di flauto con piccolo taco o sfondo e più cornice.

Il pH finale del citrato medio è 6,9 (colore verde). Questo mezzo è molto sensibile al cambiamento di pH.

Un pH 6 o inferiore, il mezzo diventa colore giallo. Questo colore non è osservato nel test dei batteri.

E a pH 7,6 o superiore, il mezzo cambia in blu dell'intensa Prussia.

Utilizzo

Simmons Citrate Agar viene utilizzato per identificare alcuni microrganismi, in particolare bacilli appartenenti alla famiglia Enterobacteriaceae e altri bacilli di glucosio non ferment.

Considerazioni finali

Il mezzo di citrato Simmons è un test molto delicato, poiché si possono ottenere falsi positivi se vengono commessi alcuni errori.

Le cure che devono essere prese sono le seguenti:

Inoculo

Non dovrebbe essere fatto un inoculo batterico molto spesso o carico. Non significa positività a prova. 

Allo stesso modo, uno spesso inoculo può generare un falso positivo, poiché i composti organici preformati all'interno delle pareti cellulari dei batteri morbounandenti possono rilasciare abbastanza carbonio e azoto per trasformare l'indicatore di pH.

Pertanto, l'ideale è seminare usando l'ago anziché la maniglia del platino, per evitare di prendere materiale in eccesso.

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Seminato

D'altra parte, quando la batteria di test biochimici per l'identificazione del microrganismo in questione è la semina, è importante che il test del citrato sia il primo a inoculare, per evitare la resistenza di proteine ​​o carboidrati da un altro mezzo.

In questa circostanza è possibile ottenere un falso positivo, poiché una di queste sostanze introdotte dall'errore sarà metabolizzata e causerà un cambiamento di pH.

Un altro modo per evitare il trascinamento della sostanza è quello di bruciare la maniglia e prendere un nuovo inoculum tra un test e un altro.

È inoltre necessario prestare attenzione quando si tocca la colonia per eseguire l'inoculo, poiché dovrebbe essere evitato di trascinare parte dell'agar coltivata da cui provengono i batteri, a causa di quanto sopra spiegato.

In questo senso, Matsen, Sherris e Branson raccomandano di diluire l'inoculo in soluzione fisiologica prima di inoculare il test di citrato per evitare il trasferimento di altre fonti di carbonio.

Intensità del colore

Va in considerazione che l'intensità del colore prodotto quando il test è positivo può variare in base alla casa commerciale.

Inoltre, ci sono microrganismi positivi a 24 ore, ma ci sono altri ceppi che richiedono 48 ore o più per produrre un cambiamento di pH.

Riferimenti

1. BBL Simmons Citrate Agar SLANTS. BD recuperato.com.
2. Simmons Citrate Agar. Recuperato da Britanialab.com.