DNA ricombinante tecnico, applicazioni e fondamentali

Lui DNA ricombinante (DNA o rDNA) è una molecola di acido nucleico artificiale creato in laboratorio, integrando due segmenti di organismo di interesse. È anche noto come DNA chimerico, grazie alla sua proprietà ibrida. Non troviamo questo tipo di DNA in natura.

La metodologia di base per generarlo include: (a) la selezione di un DNA bianco e il suo inserimento in un altro frammento di DNA (generalmente un plasmide batterico); (b) L'introduzione di questo plasmide in un batterio, (c) la selezione di batteri attraverso gli antibiotici e infine (d) l'espressione del gene.

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La tecnica sfrutta un gioco enzimatico che consente di copiare e incollare frammenti di DNA specifici per la prova del ricercatore.

L'obiettivo della tecnologia ricombinante è, nella maggior parte dei casi, l'espressione di una proteina (nota come proteina ricombinante) desiderata dal biologo molecolare per future indagini o per creare una proteina di valore commerciale e terapeutico - come l'insulina umana, ad esempio.

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Fondamenti della tecnica del DNA ricombinante e del suo uso nell'ingegneria genetica

Il dogma centrale della biologia molecolare

Tutti gli esseri organici conosciamo condividono diverse caratteristiche. Uno di questi è la natura del materiale genetico e il modo in cui vengono prodotte le proteine ​​- processo noto come "dogma" centrale della biologia molecolare.

Ad eccezione di una coppia di virus, tutti gli organismi archiviano informazioni genetiche nel DNA (acido deossiribonucleico), raccolti molto compatti e organizzati nel nucleo cellulare.

Per l'espressione genica, la molecola di DNA viene trascritta all'RNA messaggero e quest'ultima viene tradotta in linguaggio aminoacido, i blocchi strutturali delle proteine.

Cos'è un DNA ricombinante?

Tra gli anni '70 e '80, i biologi molecolari iniziarono a sfruttare i processi che si verificano naturalmente all'interno della cellula e riuscivano a estrapolarli in laboratorio.

In questo modo, un gene animale (un vertebrato, per esempio) potrebbe essere inserito in un segmento di DNA da un batterio; oppure il DNA di un batterio potrebbe essere combinato con un DNA virale. Pertanto, possiamo definire un DNA ricombinante come una molecola composta da DNA da due diversi organismi.

Una volta creata questa molecola ibrida o ricombinante, procediamo all'espressione del gene di interesse. Con la parola espressione Vogliamo fare riferimento al processo di traduzione delle proteine.

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Enzimi di restrizione e campionati: la chiave del processo

Un elemento chiave per sviluppare la tecnologia del DNA ricombinante è stata la scoperta di enzimi di restrizione.

Queste sono molecole proteiche che presentano la capacità di dividersi in DNA (nuclea) in sequenze di calcestruzzo, fungendo da "forbici molecolari". I frammenti generati da questi enzimi sono chiamati frammenti di restrizione.

Questi enzimi possono produrre nei tagli simmetrici di sequenza bianca (in entrambe le catene alla stessa altezza) o tagli asimmetrici. Un aspetto chiave dell'azione degli enzimi di restrizione è che dopo la divisione delle catene si ottiene un "bordo sciolto", complementare all'altro bordo tagliato dallo stesso enzima.

Alcuni esempi sono ECOR 1 e SMA 1. Sono attualmente noti oltre 200 tipi di enzimi di restrizione e sono disponibili in commercio.

Per essere utile, una forbice deve essere accompagnata dalla colla. Questa azione di sigillatura del DNA (precedentemente trattata con enzimi di restrizione) viene effettuata da campionati.

Tecnica: come è il DNA di un organismo in laboratorio modificato artificialmente?

Successivamente descriveremo i passaggi principali richiesti dalla tecnologia del DNA ricombinante. Tutti sono realizzati da professionisti in un laboratorio di biologia molecolare.

Cos'è un "clone"?

Prima di continuare con il protocollo sperimentale, dobbiamo notare che in biologia molecolare e biotecnologia il termine "clone" e il verbo "clonar" sono ampiamente utilizzati. Questo potrebbe portare alla confusione.

In questo contesto, non ci riferiamo alla clonazione di Tutto un organismo (come nel caso della famosa pecora di Dolly, per esempio), ma alla clonazione di un frammento di DNA, che può essere un gene. Cioè, produrre molte copie - geneticamente identiche - della sequenza.

1. Isolamento e ottenimento del DNA

Il primo passo è decidere quale sequenza desidera essere utilizzata. Questo dipende totalmente dal ricercatore e dagli obiettivi del suo lavoro. Quindi, questo DNA deve essere isolato e purificato. I metodi e le procedure per raggiungere questo obiettivo dipendono dall'organismo e dal tessuto.

Una porzione di tessuto viene generalmente presa e sottoposta a un trattamento in un appassionato di lisi. Successivamente, viene proceduta la frammentazione del materiale genetico in piccoli frammenti.

2. Vettore di clonazione

Dopo le fasi preparatorie, il ricercatore cerca di introdurre il segmento del DNA di interesse per un vettore di clonazione. D'ora in poi a questo segmento DNA lo chiameremo DNA bianco.

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Plasmidi

Uno dei vettori più usati in un plasmide di origine batterica. Un plasmide è una molecola di DNA circolare a doppia catena che troviamo naturalmente nei batteri. Sono entità al di fuori del cromosoma batterico - cioè sono extracromosomiali e si trovano naturalmente in questi procarioti.

Gli elementi di base di un vettore sono: (a) un'origine della replica, che consente la sintesi del DNA; (b) agente di selezione, che consente di identificare gli organismi che trasportano il plasmide con DNA bianco, come la resistenza a un antibiotico; e (c) sito multiclonazione, in cui si trovano le sequenze che saranno riconosciute dagli enzimi di restrizione.

Il primo DNA ricombinante di successo in laboratorio è stato clonato nel plasmide PSC101 dai batteri E. coli. Questo contiene un sito di restrizione per l'enzima di restrizione Ecori e un gene di resistenza a un antibiotico, oltre all'origine della replicazione.

L'inserimento del DNA bianco nel plasmide viene eseguito usando gli strumenti molecolari degli enzimi e le leghe di restrizione descritte nella sezione precedente.

Tipi di vettori sostanziali

Oltre ai plasmidi, il DNA può essere inserito in un altro vettore, come il batteriofago Lambda.

3. Introduzione del DNA ricombinante

Una volta che è stata ottenuta la molecola di DNA ricombinante (gene di interesse per il plasmide o altro vettore).

Per introdurre il DNA estraneo in un batterio, viene utilizzata una tecnica chiamata trasformazione batterica, in cui il corpo viene sottoposto a un trattamento con cationi bivalenti che lo rende suscettibile alla presa del DNA.

Metodologicamente, non possiamo garantire che il 100% dei batteri nel nostro raccolto abbia effettivamente preso la nostra molecola di DNA ricombinante. È qui che entra in gioco la parte del plasmide che contiene resistenza agli antibiotici.

Pertanto, i batteri che hanno preso il plasmide saranno resistenti a un certo antibiotico. Per selezionarli, sarà sufficiente per l'applicazione di detto antibiotico e prendere i sopravvissuti.

4. Proteina "raccolto"

Dopo aver selezionato i batteri con il nostro DNA ricombinante, procediamo a utilizzare il meccanismo enzimatico ospite per generare il prodotto proteico di interesse. Man mano che i batteri vengono riprodotti, il plasmide passa alla sua prole, quindi non si perde durante la divisione.

Questa procedura utilizza i batteri come una sorta di "fabbrica" ​​di proteine. Più tardi vedremo che è stata una procedura molto rilevante nello sviluppo di trattamenti medici efficaci.

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Una volta che il raccolto è pronto e i batteri hanno prodotto grandi quantità di proteine, la cellula o la rottura della cellula è. Esiste una vasta gamma di tecniche biochimiche che consentono la purificazione delle proteine ​​in base alle loro caratteristiche fisiche chimiche.

In un altro contesto sperimentale potremmo non essere interessati a generare proteine, ma siamo interessati a ottenere la sequenza del DNA di per sé. In tal caso, il plasmide servirebbe per la creazione di più copie del frammento che ci interessa con l'obiettivo di avere una quantità sufficiente del DNA bianco per eseguire gli esperimenti pertinenti.

Applicazioni

La tecnologia del DNA ricombinante ha aperto un numero infinito di possibilità per biologia molecolare, biotecnologia, medicina e altre aree correlate. Le tue applicazioni più eccezionali sono le seguenti.

Analisi genetica

La prima applicazione è direttamente correlata ai laboratori di biologia molecolare. La tecnologia del DNA ricombinante consente ai ricercatori di comprendere la normale funzione dei geni e le proteine ​​generate possono essere utilizzate nella ricerca successiva.

Industria farmaceutica

Le proteine ​​prodotte utilizzando la procedura di DNA ricombinante hanno applicazioni in medicina. Due esempi molto rilevanti sul campo sono l'insulina umana e l'ormone della crescita, che viene applicato in pazienti che non hanno tale proteina.

Grazie al DNA ricombinante, queste proteine ​​possono essere generate senza la necessità di estrarre da un altro essere umano, che rappresenta ulteriori complicanze metodologiche e rischi per la salute. Ciò ha contribuito a migliorare la qualità della vita di innumerevoli pazienti.

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